Este protocolo demonstra uma placa de cultura de células de microtextura projetada para o crescimento de centenas de organoides com conhecimento de material e totalmente compatível com microscopia. Nossa técnica permite gerar eficientemente milhares de organoides, totalmente compatíveis com imagens de longo prazo e cultura celular de longo prazo. Este protocolo é de forte interesse para aplicações biomédicas, como pipeline de triagem de medicamentos e domínios de pesquisa de câncer.
A técnica apresentada neste protocolo é fácil de dominar após algumas tentativas por qualquer pessoa que tenha experiência com procedimentos laboratoriais e microscopia óptica. Para começar, corte pequenas porções do molde PDMS na dimensão necessária para o dispositivo final. Cortá-los paralelos às direções XY da matriz.
Coloque um dos dados de molde PDMS preparados virado para baixo na seção plana do PDMS. Em seguida, usando uma pipeta, adicione aproximadamente 0,1 a 0,2 mililitros de adesivo curável UV a um lado do molde. Siga a progressão do líquido dentro da cavidade usando um microscópio óptico invertido com ampliação de 10X.
Exponha o adesivo à luz UV para curá-lo. Ajuste o tempo de exposição dependendo da densidade de potência da fonte UV, conforme descrito no manuscrito do texto. Usando a quantidade excessiva de adesivo em uma borda, segure o adesivo curado no substrato PDMS plano, pressionando-o suavemente com um dedo.
Enquanto isso, usando uma pinça, aperte um canto do molde ao lado da mesma borda que está sendo pressionada e retire lentamente o molde, garantindo que o filme texturizado não seja levantado. Apare o excesso de adesivo e substrato PDMS usando uma lâmina de barbear para deixar a camada curada, texturizada e adesiva plana no PDMS com o excesso de substrato em apenas uma borda. Trate uma tampa limpa com um processo curto de plasma de oxigênio para melhorar sua hidrofilicidade.
Após a ativação do plasma, revesti-la por rotação a fina camada de adesivo curável por UV colocando a tampa no mandril a vácuo de um revestidor de spin padrão e despejando uma pequena gota de adesivo no centro da tampa. Execute o processo de revestimento de rotação conforme descrito no manuscrito do texto. Se o revestimento por rotação não estiver disponível, solte aproximadamente 0,1 mililitros de adesivo curável por UV em uma tampa limpa usando uma pipeta.
Pegue uma segunda tampa e coloque-a em cima da primeira para fazer com que o adesivo líquido se espalhe uniformemente entre as duas tampas. Uma vez que o adesivo tenha atingido a borda das tampas, separe-as suavemente deslizando uma sobre a outra. Uma vez separadas, ambas as coberturas serão totalmente revestidas com uma fina camada de adesivo líquido.
Após o revestimento por centrifugação, pré-cure o adesivo por exposição aos raios UV. Ajuste o tempo de exposição dependendo da densidade de potência da fonte UV utilizada. Pegue um dos filmes texturizados e coloque-o em contato com a tampa revestida com adesivo. Certifique-se de que o contato entre o adesivo parcialmente curado e o filme texturizado seja o mais uniforme possível.
Nesta fase, o adesivo na tampa deve ser sólido o suficiente para evitar o refluxo e o contato pode ser otimizado pressionando suavemente a tampa. Exponha as tampas à luz UV até que a camada adesiva revestida esteja totalmente curada. Isso selará o filme texturizado na tampa e fornecerá isolamento à prova de vazamento entre as cavidades do perímetro.
Em seguida, usando uma pinça, aperte o PDMS na borda onde o excesso de material foi deixado após o corte e retire o substrato plano do PDMS. Esta etapa permite que a camada de filme texturizado adira à tampa com acesso aberto na parte superior para a semeadura de células. Antes da semeadura celular, em um dispositivo passivado com copolímero biométrico, conforme descrito no manuscrito, dispense um mililitro de PBS estéril nas placas de Petri de cultura celular de 35 milímetros.
Degas do prato com PBS estéril usando a câmara de vácuo por 10 minutos, seguido por várias rodadas de pipetagem para remover todas as bolhas. Substitua o PBS por meio de cultura estéril e esterilize a placa com luz UV por 30 minutos sob um exaustor de cultura celular. Prepare uma suspensão celular seguindo as recomendações de tripsinização ou preparação de suspensão celular para as células de interesse, conforme descrito no manuscrito do texto.
Conte e ajuste a concentração celular para 500.000 células por mililitro no meio de cultura celular recomendado. Remova o tampão PBS da placa de cultura de células de 35 milímetros e, em seguida, dispense um mililitro da suspensão celular ajustada. Coloque o prato de cultura celular de volta na incubadora de células por 10 minutos.
Aproximadamente 80 a 100 células entrarão em cada cavidade do perímetro. Após aproximadamente 10 minutos de incubação, recupere a placa de cultura celular da incubadora e aspirar suavemente a suspensão celular para remover as células não aprisionadas. Adicione um mililitro de meio de cultura ao prato de cultura e coloque-o de volta na incubadora de células.
Opcionalmente, para recuperar os organoides depois que eles crescerem nos poços, aperte a camada adesiva texturizada na borda cortada usando pinças e descasque-a suavemente da tampa de vidro, mas mantenha-a imersa no meio. O aumento da concentração de copolímero biométrico aumentou a espessura do revestimento. A desgaseificação completa das placas de cultura celular foi essencial para remover as bolhas de ar presas nas cavidades do perímetro.
Os organoides foram formados após os dois e 15 dias de cultivo. A microscopia confocal do disco giratório mostrou imagens representativas dos organoides e reconstrução 3D. Ao preparar o prato de cultura, é importante prestar atenção à montagem da pilha de molde ou substrato e garantir um bom contato entre o filme texturizado e o coverslip.
A contenção proporcionada por nossas microcavidades e a ausência de perda de material atraíram a atenção de pesquisadores de biologia espacial interessados em estudar o efeito da microgravidade na homeostase organoide.
