Nosso método é significativo porque permite que os pesquisadores isolem e manipulem diferentes tipos de células para a investigação de suas contribuições individuais de linhagem à forma e função tecidual. Esta técnica é um método suave e eficiente para separar tipos de células e, como resultado, a integridade das células é preservada para a cultura 3D. Essa técnica também pode ser aplicada a outros sistemas para isolar células que não possuem biomarcadores bem caracterizados.
Para colher as glândulas mamárias número dois, três, quatro e cinco de um rato fêmea de 10 a 14 semanas, primeiro faça uma incisão de um centímetro na linha média entre os dois traseiros. Estenda o corte até o pescoço e faça pequenos cortes laterais da incisão da linha média em direção aos membros. Em seguida, estique a pele ensinada antes de fixá-la com um alfinete em cada lado do animal.
Usando fórceps, colete os linfonodos das glândulas número quatro. Para remover as glândulas mamárias, use uma tesoura afiada para cortar sob cada região do tecido, colocando os tecidos em 50 mililitros de quatro graus Celsius DMEM-F12 suplementados com 5% de FBS e antibiótico-antimíctico à medida que são colhidos. Quando todos os tecidos tiverem sido coletados, corte as glândulas até que as peças possam caber facilmente através de uma ponta de pipeta de um mililitro girando a placa conforme necessário para que todos os tecidos sejam picados uniformemente.
Em seguida, transfira os fragmentos em três mililitros de meio de digestão em um único poço de um prato de seis poços de baixa adesão por 14 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Na manhã seguinte, pipeta suavemente os tecidos 10 vezes com uma micropipette de um mililitro e transfira os fragmentos de tecido em um tubo de 15 mililitros. Recolher o tecido por centrifugação e resuspensar a pelota em cinco mililitros de DPBS frescos.
Filtre a suspensão através de um coador de células de nylon pré-molhado de 70 micrômetros, enxaguando o tubo no coador quatro vezes com 10 mililitros de 37 graus Celsius DMEM-F12 por lavagem. Para liberar os fragmentos de tecido, segure a aba do coador com os dedos enluvados e inverta o coador sobre um prato de cultura tecidual de 60 milímetros. Passe quatro alíquotas mililitros de meio de manutenção através da parte inferior do coador e examine rapidamente o prato para células únicas, gotículas de gordura e tecido contaminante sob um microscópio invertido.
Em seguida, coloque a placa na incubadora de cultura celular por 24 horas para permitir que os fragmentos de tecido aderam ao prato e gerem fragmentos bicamadas. Para separar as células mioepiteliais das células epiteliais luminais, enxágue o prato com um mililitro de DPBS antes de adicionar um mililitro de 0,5% de trippsina-EDTA fresco às células. Monitore cuidadosamente a digestão sob um microscópio invertido.
A camada externa das células mioepithelialas começará a se desprender dentro de três a seis minutos. Quando as células mioepithelialas se separarem, transfira o supernante para um tubo de 15 mililitros contendo dois mililitros de 10% FBS em DPBS. Sem perturbar as células epiteliais luminais, enxágue suavemente o prato com dois mililitros de DPBS antes de adicionar um mililitro fresco de trypsin-EDTA às células restantes.
Após sete a 15 minutos, sacie a reação enzimática com dois mililitros de 10% FBS na PBS e transfira as células para um novo tubo de 15 mililitros. É fundamental monitorar de perto as células durante a trippsinização diferencial e não digerir demais as células. Quando ambas as frações foram coletadas, centrifugar as células para remover qualquer reagente de dissociação residual e resuspensar as pelotas em 250 microliters de meio de manutenção por tubo.
Após a contagem, diluir cada população celular para uma população de 1,2 vezes 10 para as quatro células por concentração de poço em meio de manutenção fresca. Adicione 90 microliters de matriz extracelular de 50% no DMEM-F12 sem fenol vermelho a cada poço de um slide de câmara de oito poços. Quando todos os poços tiverem sido revestidos, solidifique a camada base da incubadora de cultura celular por 30 minutos.
Durante essa polimerização, colete as frações celulares por centrifugação e resuspenda cada população em 100 microlitadores de matriz 10% extracelular em 90% de crescimento médio por poço. Em seguida, adicione 100 microliters de cada poço e permita que as co-culturas se contentem por 20 minutos na incubadora de cultura celular. No final da incubação, adicione cuidadosamente 100 microliters de crescimento médio ao lado de cada parede da câmara e devolva o slide à incubadora de cultura celular.
Imagem as células a cada 24 horas para acompanhar seu crescimento e renovar suavemente o meio de crescimento a cada dois ou três dias. Para corrigir os organoides para imunostaining, no momento experimental apropriado, aspire cuidadosamente o meio de cada slide a ser imageado e enxágue cada poço com 200 microliters de DPBS por poço. Fixar os organoides com 200 microlitadores de quatro graus Celsius paraformaldeído por 10 minutos à temperatura ambiente antes de tratar os organoides com 200 microlitrais de 0,2% de glicina em DPBS por poço por 30 minutos à temperatura ambiente.
Ao final da incubação, permeabilize os organoides com 0,25% triton X-100 em DPBS por 10 minutos à temperatura ambiente seguido pelo bloqueio de ligação inespecífica com soro de burro de 5%ou o soro apropriado que corresponde à espécie do anticorpo secundário em DPBS por uma hora com balanço. Em seguida, rotule as células com 125 a 200 microliters dos anticorpos primários apropriados de interesse em 1% de soro de burro em DPBS durante a noite a quatro graus Celsius com balanço. Na manhã seguinte, lave cada poço duas vezes com 200 microlitadores de DPBS mais triton X-100 antes de rotular os organoides com os anticorpos secundários conjugados fluorescência apropriados por 45 minutos à temperatura ambiente com balanço protegido da luz.
Em seguida, lave cada poço duas vezes com DPBS fresco mais triton X-100 como demonstrado e imagem os organoides por microscopia de fluorescência de acordo com os protocolos padrão. Após 24 horas de incubação, fragmentos epiteliais purificados aderiram ao fundo do prato de cultura formando estruturas planas semelhantes a panquecas com uma camada externa de células mioepithelialas circundando uma camada interna de células epiteliais luminais. O tratamento de trippsina destaca diferencialmente as células com as células mioepiteliais se desprendendo primeiro e aparecendo como células arredondadas brilhantes que circundam o núcleo das células epiteliais luminais cuboidas restantes.
A pureza geral dos dois compartimentos celulares é de cerca de 90% avaliada pela expressão de queratina-14 e e-cadherina dentro das duas populações. Após 10 dias de cultura em matriz 10% extracelular em uma base de matriz 50% extracelular como demonstrado, os organoides de células epiteliais mioepitheliais formaram grandes estruturas ramificadas com lúmens bem desenvolvidos. A diferenciação no quinto dia com a adição ao meio da alveologênese induz a formação de organoides maiores e mais ramificados que contenham leite.
É importante lembrar de lavar o filtro cuidadosamente ao coletar o epitélio para garantir que não haja contaminantes estrômicos. Para consultar as mudanças na expressão genética, os pesquisadores podem coletar RNA dos organoides liberando-os da matriz extracelular usando uma solução de recuperação. O paraformaldeído é considerado perigoso e os pesquisadores devem usar equipamentos de proteção individual e trabalhar dentro de uma coifa ao usar este reagente.
