Nosso protocolo fornece medidas in vivo e ex vivo para visualizar e caracterizar a vasculatura hialoide dentro do olho como um modelo experimental útil para estudar a regressão vascular. Esta técnica combina tanto a observação longitudinal in vivo de vasos hialoides em camundongos vivos e visualização ex vivo e quantificação precisa de vasos hialoides inteiros dissecados. Nossa técnica fornece um método prático e viável para estudar a patogênese e mecanismos básicos de vasculatura fetal persistente.
Este método também fornece insights sobre mecanismos celulares e moleculares envolvidos na regulação da regressão vascular ocular que pode ser relevante para a pesquisa de angiogênese em outros órgãos. Os passos de isolamento hialoide podem ser tecnicamente desafiadores para iniciantes. Muita prática e paciência ajudarão a garantir uma dissecção bem sucedida.
A visualização deste método fornecerá informações práticas detalhadas e dicas sobre a técnica que podem auxiliar os espectadores a dominar as habilidades de forma mais eficiente. Para tomografia óptica de coerência ou imagem OCT, ajuste o mouse e a sonda para que a cabeça nervosa óptica esteja no centro do campo visual na imagem fundus e ajuste o foco e o ângulo da linha indicada no software de imagem OCT para revelar os vasos hialoides persistentes antes de obter imagens. Para a angiografia de fundus fluoresceína dos vasos hialoides, ajuste o alinhamento ligeiramente para posicionar a cabeça do nervo óptico no centro do campo de visão e altere o filtro do microscópio para um canal fluorescente verde.
Em seguida, concentre-se nos vasos hialoides persistentes e obtenha múltiplas imagens em uma, três, cinco e 10 minutos de pós-injeção para determinar o melhor ponto de tempo para a relação sinal-fundo para observar os vasos. Para dissecção e visualização de vasos hialoides ex vivo usam fórceps de microcirurgia para abrir as pálpebras de um rato pós-natal de oito dias e colocar fórceps de microcirurgia curva sob o globo na órbita de um olho para agarrar o nervo óptico sem apertar o globo ocular. Puxe suavemente e remova o globo ocular com fórceps e fixe o olho em 4% de paraformaldeído à temperatura ambiente.
Após 30 minutos, transfira os globos oculares fixos para PBS gelado sob um microscópio de dissecção e injete 50 microlitros de solução de gelatina no corpo vítreo do globo ocular em quatro locais espaçados uniformemente diferentes ao redor do limbus. Em seguida, incubar o globo ocular no gelo por 30 minutos para solidificar a gelatina injetada dentro do espaço vítreo. Quando a gelatina tiver curado transfira o globo ocular para uma placa de Petri de PBS sob o microscópio dissecando e use uma tesoura de microcirurgia para fazer uma incisão no limbus para remover a córnea.
Corte e remova o nervo óptico sob o microscópio dissecando. Utilizando dois pares de fórceps descascam e descartam as camadas de esclera, coroide e pigmento da retina, seguidas pela remoção da íris. Com o lado nervoso óptico da retina voltado para cima e as lentes viradas para baixo, injete 50 microliters de PBS logo abaixo do copo de retina para permitir o acúmulo do PBS entre o corpo vítreo gelatinizado e a retina.
Use fórceps de microcirurgia para descascar suavemente o copo de retina e o corpo ciliar do corpo vítreo. Usando uma tubulação de transferência, transfira o copo de gelatina contendo o tecido hialoide imerso em PBS para um slide de microscópio. E vire os tecidos restantes para que a lente fique virada para cima.
Em seguida, levante a lente e solte suavemente a conexão entre a lente tunica vasculosa lentis e a vasa hyaloidea propria antes de cortar a artéria hialoide com a tesoura de microcirurgia para remover a lente tunica vasculosa lentis. Mantenha a região vasa hyaloidea propria do copo hialoide para a montagem plana. Para a montagem plana das amostras do vaso hialoide, enxágue suavemente o copo hialoide com PBS fresco para remover quaisquer detritos de dissecção.
Com o tecido flutuando em PBS use fórceps de microcirurgia para organizar suavemente e ajustar a posição do copo hialoide gelatinizado para que a borda do copo esteja virada para baixo. Coloque o slide com o copo de hialoide imerso em PBS em um aquecedor de slides a 37 graus Celsius. Depois que a gelatina derreter e o hialoide achatar remover o slide quando ele mal está seco e adicionar uma gota de meio de montagem anti-fade com DAPI para manchar os núcleos nos vasos hialoides.
Em seguida, coloque suavemente uma mancha de cobertura no hialoide para completar a montagem plana. Para imaginar a coloração da DAPI dos vasos hialoides, transfira a amostra montada para o estágio de um microscópio fluorescente e confirme que a artéria hialoide central é visível. Em seguida, identifique os ramos do vaso diretamente derivados da artéria hialoide e conte manualmente o número de ramos de vasos para quantificação.
Aqui, são mostradas vistas transversais das imagens de OCT para os tecidos de retina e hialoides em tipo selvagem de três meses de idade e proteína relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade cinco ou camundongos de nocaute LRP5, um modelo animal com vasos hialoides persistentes. Nestas imagens de angiografia de fluoresceína fundus de vasos hialoides persistentes oito ramos de vasos hialoides são observados no corpo vítreo de camundongos eliminatórios de seis semanas de idade, enquanto nenhum remanescente dos vasos hialoides é observado em animais do tipo selvagem da mesma idade. Nestes vasos hialoides, os suportes planos das células vasculares e dos macrófagos associados podem ser identificados por sua coloração nuclear da DAPI.
E cada linha de células ramificadas da artéria hialoide central representa um vaso de vasa hyaloidea propria. Ratos do tipo selvagem têm uma média de 12 ramos de vasos hialoides no oitavo dia pós-natal, enquanto filhotes de nocaute LRP5 com idade exibem cerca de 25 ramos de vasos hialoides demonstrando uma regressão significativamente prejudicada da vasculatura hialoide. Além disso, o desenvolvimento vascular de retina retardada e incompleto também é observado em filhotes de nocaute LRP5.
De fato, os vasos hialoides ainda podem ser identificados em seções transversais de seções de tecido ocular nocaute LRP5 no oitavo dia. Considerando que os olhos do tipo selvagem não exibem mais esses vasos. A coisa mais importante a se lembrar é ser gentil e paciente ao isolar o sistema hialoide da retina e outros tecidos oculares.
Depois de isolar os vasos hialoides imunossundo com diferentes marcadores celulares podem ser realizados para descobrir as interações celulares que regulam a regressão hialoide. Esta técnica explora os mecanismos celulares e moleculares subjacentes da vasculatura fetal persistente na pesquisa de angiogênese ocular. Paraformaldeído, cetamina e xilazina são perigosos.
Por favor, prepare estes reagentes em um capô de fumaça química usando o equipamento de proteção pessoal adequado.
