Embora a angioplastia ajude pacientes com doença arterial coronariana, eventos cardiovasculares ainda podem ocorrer após o procedimento. Como os MPCs e moléculas solúveis são obtidos a partir da circulação coronária, elas podem ser correlacionadas ao grau de dano vascular e reparação. Os níveis de Mediador coronariano e solúvel podem, portanto, ser usados para estimar eventos cardiovasculares e prognósticos em pacientes com doença arterial coronariana submetidas a angioplastias coronárias.
Os MPCs e moléculas solúveis também podem ser usados para estimar complicações e prognósticos que ocorrem em diferentes ambientes isquêmicos, como o derrame isquemico recorrente de membros. Os que demonstrarão o procedimento serão Eduardo Vera-Gomez e Alejandro Hernandez-Patricio, técnicos de laboratório, e Karen De La Vega-Moreno e Carlos Zamora-Aleman, estudantes de graduação. Também estarão em demonstração Gabriela Alexandra Dominguez-Perez, estudante de Mestrado em Ciências, Alberto Melchor-Lopez, doutorando, e Mario Antonio Tellez-Gonzalez, colaborador do Mestrado em Ciências.
Dentro de uma hora após a coleta, transfira seis mililitros da amostra de sangue colhida para um tubo cônico de 15 mililitros e diluir o sangue em uma proporção de um para um na PBS. Adicione dois mililitros de gradiente de densidade médio a três tubos de ensaio e transfira cuidadosamente três alíquotas iguais de sangue diluído em cada tubo de gradiente de densidade. Separe as células por centrifugação e transfira as células na interface para um novo tubo.
Lave as células coletadas uma vez em dois mililitros de PBS por seis minutos, seguido por seis lavagens em dois mililitros de PBS frescos por lavagem por dois minutos. Após a última lavagem, suspenda a pelota celular contendo MPC em um mililitro de PBS para contagem e adicione uma vez dez às seis células para rotular cinco tubos de citometria de fluxo de mililitros. Pelotar as células por centrifugação e adicionar 100 microliters do anticorpo apropriado de interesse, diluído em solução de incubação de anticorpos para cada tubo.
Misture suavemente as células com cada coquetel de anticorpos adicionados por 10 segundos, e coloque as amostras a quatro graus Celsius, protegidas da luz, por 20 minutos. Ao final da incubação, centrifugar as amostras e suspender as pelotas em 500 microliters de PBS complementados com dois milimônios EDTA. Usando controles combinados com isótipo para configurar a coloração de fundo, analisar as amostras por citometria de fluxo de acordo com os protocolos padrão, gating nos linfócitos em um gráfico de dispersão para a frente, para excluir granulócitos residuais, detritos celulares e outras partículas.
Defina um portão para conter um alto número de células com um fenótipo CD34 positivo CD34-positivo. Em seguida, use o portal CD34 positivo CD34 positivo para selecionar para células receptor de domínio de inserção de quinase CD133 ou CD184-positive. As subsu populações do MPC podem então ser identificadas por seus marcadores de superfície celular específicos e relatadas como a porcentagem de eventos fechados.
Para determinar a concentração de biomarcadores solúveis nas amostras de sangue coletadas, primeiro, lave as placas ELISA pré-revestidas adequadas duas vezes com o tampão de lavagem fornecido pelo kit e rotule os tubos padrão, amostra e controle. Centrifugar a amostra de sangue para separar os componentes sanguíneos e alíquotar do plasma nos tubos de amostra. Transfira as normas, amostras e controles para os poços apropriados e sela e incubar a placa a 37 graus Celsius por 90 minutos.
No final da incubação, descarte o conteúdo do poço e adicione o anticorpo de detecção de biotina a cada poço. Após uma incubação de uma hora a 37 graus Celsius, descarte o conteúdo da placa e lave os poços três vezes com tampão de lavagem fresco por lavagem. Após a última lavagem, incubar as amostras com solução de trabalho Streptavidin por 30 minutos a 37 graus Celsius seguidas por três lavagens, como demonstrado.
Após a última lavagem, trate as amostras com substrato de tetrametilbenzidina por 30 minutos a 37 graus Celsius. Quando a cor se desenvolver, adicione a solução stop do kit e leia a absorvância de densidade óptica em um leitor ELISA de microplacar. Para determinar a concentração do fator de necrose tumoral alfa, e interleucina-1 beta, usando multiplexamento imunomagnético, rotule os tubos padrão, amostra e controle e vórtice os frascos de contas magnéticas por 30 segundos.
Adicione contas aos poços apropriados da placa de ensaio multiplexa. Quando todas as contas tiverem sido adicionadas, insira com segurança a lavadora de placa magnética portátil e espere dois minutos para que as contas se acumulem no fundo de cada poço, antes de inverter rapidamente tanto a lavadora de placa magnética portátil, quanto o conjunto da placa sobre um recipiente de resíduos. Em seguida, adicione 150 microliters de tampão de lavagem a cada poço e espere 30 segundos para permitir que as contas se acumulem na parte inferior.
Descarte o conteúdo novamente como acabou de demonstrar e adicione 25 microliters de tampão de ensaio universal e 25 microliters dos padrões, amostras e controles preparados. Sele a placa para uma incubação de pelo menos 60 minutos, protegida da luz à temperatura ambiente e 500 rotações por minuto. No final da incubação, adicione 150 microliters de tampão de lavagem a cada poço e deixe as contas se contentarem por 30 segundos.
Em seguida, use a arruela de placa para descartar o conteúdo do poço e rotular cada poço com 25 microliters de mistura de anticorpos de detecção seguidos por duas lavagens, como demonstrado. Após a segunda lavagem, incubar as amostras com 25 microliters de Streptavidin PE por 30 minutos em temperatura ambiente. Ao final da incubação, adicione 120 microliters de tampão de leitura a cada poço e sele a placa para uma incubação de cinco minutos, protegida da luz à temperatura ambiente, para 500 rotações por minuto.
Em seguida, carregue a placa em um leitor de ensaio multiplexing e ajuste os parâmetros de leitura de acordo com cada analito. Coronário, vênus-sinuso e sangue periférico foram coletados de 52 pacientes submetidos à angiografia coronariana e demonstraram alta prevalência de hipertensão e dislipidemia. A concentração coronária de base da maioria dos PCM foi significativamente menor em pacientes que desenvolveram grandes eventos cardiovasculares adversos, com maior diminuição nas subpopulações de MPC CD34-positivo CD133-positivo, e CD45-positivo, CD34-positivo, CD133-positivo, CD184-positivo.
Da mesma forma, os pacientes que desenvolveram grandes eventos cardiovasculares adversos tiveram um aumento da linha de base em quantidades coronárias de ICAM-1 solúvel e menores quantidades de proteína metallomatrix 9. Os MPCs coronários e o ICAM-1 solúvel demonstraram uma capacidade prognóstica para uma sobrevida adversa sem eventos cardiovasculares. Curiosamente, a expressão do fator de necrose tumoral alfa demonstrou variações de acordo com o tempo de medição e a localização da amostragem coronária com base na comparação de diferentes áreas de lúmen na mesma artéria coronária, utilizando ultrassom intravascular.
Durante o isolamento do MPC, certifique-se de transferir o sangue para o gradiente de densidade, e coletar as células da interface após a centrifugação cuidadosamente. O vórtice periódico previne a precipitação de contas e o uso de uma arruela de placa magnética ajuda a manter as contas dentro dos poços durante as lavagens. MpCs coronárias e moléculas solúveis são úteis para estratificar o risco de eventos cardiovasculares durante o acompanhamento após a angioplastia, auxiliando no fornecimento de prevenções secundárias a indivíduos de alto risco, pois essa técnica reflete o processo fisiopatológico que ocorre durante o cessar-solução, podendo ser útil para condições em que a biologia vascular desempenha um papel.
