Nosso protocolo funciona como uma ferramenta para encontrar compostos que inibem a des atividade da pirofosfatase ligada à membrana. E esses inibidores podem ser usados no tratamento de várias doenças parasitárias. Este protocolo é barato e simples produzindo cores estáveis por um longo tempo sem mostrar qualquer interferência na presença de alta concentração fosfolipídid necessária para a reativação da enzima.
Prepare 10 mililitros da solução tampão de reativação, contendo 20 mililitros M-E-S em PH 6,5, 3,5% de volume de glicerol, dois milimões D-T-T e 0,05% D-D-M. Prepare 10 mililitros do misturador de reação, contendo 200 mililitros tris em PH oito. Oito cloreto de magnésio mililitro, 333 cloreto de potássio milimil, e 67 cloreto de sódio mililitro.
Para preparar 30 miligramas por lipossomos mililitros para reativação enzimápica. Primeiro, adicione 10 mililitros de 20 mililamores de cloridrato tris em PH oito, com um mililitro D-T-T a 0,3 gramas de L alfa fosphatidylcolina de soja. Coloque o lipossomo no gelo e sonicato com um segundo pós-intervalos por um minuto.
Pare por um minuto e repita até que a solução se torne amarela transparente. Alíquotar os lipossomos em 100 microliters, congelar o nitrogênio líquido e armazenar a 80 graus Celsius negativos até ser usado. Para reativar a enzima, descongele a solução lipossa à temperatura ambiente.
Misture 40 microliters da solução liposso com 22,5 microliters de 20% D-D-M. Mantenha a mistura a 55 graus Celsius por 15 minutos. E deixe esfriar até a temperatura ambiente.
Em seguida, adicione 36,5 microliters da solução de tampão de reativação. Misture. E adicione um microliter de proteína concentrada para fazer uma concentração total de 0,13 miligramas por mililitro. Em seguida, transfira 20 microliters da enzima reativada para 1480 microliters da mistura de reação.
Misture suavemente e use imediatamente. Primeiro, dissolver os compostos em D-M-S-O para fazer soluções de estoque de 50 mililitros em 200 microliters. Para compostos solúveis diluem a solução de estoque com água para um mililitro em micro tubos, para dar dois, 10 e 100 micromolar.
Para cada diluição, vórtice a solução composta para a mistura adequada. Depois disso, verifique se há divergências compostas e, usando um tubo multicanal, distribua 75 microliters da mistura de reação em cada poço em uma placa de 96 poços. Adicione 75 microliters de cada composto e água como controle em triplicado, e misture por pipetação para cima e para baixo cinco vezes.
Meça cada poço a 300 volts usando um nefielômetro de microplaca. Para preparar a solução citrato de arsênico, peso cinco gramas de arsenita de sódio e cinco gramas de dihidrato de citrato de trissódio, dissolver ambos os compostos em 100 mililitros de água. Em seguida, adicione cinco mililitros de ácido acético glacial.
Misture e adicione água a 250 mililitros, armazene à temperatura ambiente protegido da luz. Em seguida, prepare a solução A adicionando 10 mililitros de ácido clorídrico molar de 0,5 molar a 0,3 gramas de ácido ascórbico Dissolva o ácido ascórbico por vórtice. Prepare a solução B adicionando um mililitro de água gelada a 70 miligramas de tetrahidrat de amônio tetrahidrate, e vórtice para dissolver.
Armazene a solução A e B no gelo. Para preparar o padrão fosfato com concentração de zero, 62,5, 250 e 500 micromolar para calibração. Adicione zero microliters, 12,5 microliters, 50 microliters e 100 microliters de 5 milimolars de dihidrato de fosfato de dissódio a quatro micro tubos contendo 370 microliters da mistura de reação.
Cubra até um mililitro com água. Agora adicione um mililitro da solução B a 10 mililitros de solução A, misture à mão e armazene a solução no gelo. Usando um pipet multicanal, adicione 40 microlitadores de zero, 62,5, 250 e 500 padrão de fosfato micromolar aos scripts do tubo em triplicado.
Em seguida, adicione 25 microliters de solução composta e 15 microliters de mistura de solução M-P-P-A de cada tubo. Exceto os tubos contendo padrão fosfato. Sele as tiras do tubo com uma folha de vedação adesiva.
Corte a folha de vedação para separar cada tira do tubo. Em seguida, pré-incubar a amostra por cinco minutos a 71 graus Celsius. Coloque a amostra no bloco de aquecimento com intervalos de 20 segundos entre cada tira.
Para cada tira, abra a vedação adesiva. Usando um pipet multicanal, adicione 100 microliters de dois difosic pirofosfato de sódio molar. E misture por pipetting para cima e para baixo por cinco vezes.
Sele novamente a tira do tubo usando a mesma vedação. Incubar novamente a 71 graus Celsius por cinco minutos. Depois disso, coloque as amostras no aparelho de resfriamento com intervalo de 20 segundos entre cada tira.
Deixe esfriar por cinco minutos e, em seguida, centrifugar cada tira brevemente para decantar as gotas de água sob a folha de vedação. Coloque a tira de volta no aparelho de resfriamento, remova a vedação e deixe esfriar por mais cinco minutos. Em seguida, adicione 60 microliters de solução A e B, misture por pipetação para cima e para baixo por cinco vezes, e mantenha as tiras do tubo no aparelho de resfriamento por mais 10 minutos.
Em um capô de fumaça, adicione 90 microliters da solução citrato de arsenita e mantenha em temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos. Para produzir uma cor azul estável. Distribua 180 microliters de cada mistura de reação em uma microplaca de poliestireno claro de 96 poços.
Use um espectrômetro de microplape para medir a absorvência de cada poço a 860 nanômetros. Neste protocolo, oito compostos foram testados juntamente com o I-D-P, um inibidor comum de fosfatese piro como um controle positivo. Após a adição da solução A e B, e citrato de arsenita, uma cor azul em 30 minutos de incubação à temperatura ambiente.
Todas as três concentrações de compostos não inibidores, apresentaram a mesma intensidade de cor azul. Assim como e-1 para E-3 sem qualquer inibidor. O enredo da atividade enzimática contra a concentração de cada composto testado, mostra que o composto com atividade de inibição formou um encaixe de curva não linear.
O enredo do I-D-P como um controle positivo, mostra claramente uma diminuição da atividade em concentrações mais altas. A curva de inibição para compostos um, cinco, seis, sete e oito. Apresenta concentrações inibitórias semi-máximas em 1,7 micromolar, 21,4 micromolar, 58,8 micromolar, 239,0 micromolar e maior que 500 micromolar, respectivamente.
Lembre-se de preparar a solução M-P-P-A. Pouco antes do início do ensaio.
