Este método fornece uma estratégia eficiente para o preparo de andaimes funcionais para a pesquisa de tumores ósseos. Descelularizou a matriz óssea extracelular, mostrou sorocompatibilidade variável para a sobrevivência e atividades das células osteossarcoma. A principal vantagem dessa técnica é que a cultura das células osteossarcoma na matriz derivada do osso mostra morfologia altamente heterogrógena semelhante a uma histopatologia osteossarcoma clínica.
O método fornece modelo ideal para investigar o desenvolvimento, a progressão da sensibilidade medicamentosa de tumores ósseos, como osteossarcoma, sarcoma Ewing, e outros tumores malignos metástases para osso. Para começar, obtenha camundongos BALB/c de quatro a seis semanas de idade, depois de eutanásia de um rato usando uma tesoura cirúrgica estéril, corte fíbula fresca, tíbia e fêmur de um membro traseiro. Com a ajuda da pinça, retire o tecido epitelial e, em seguida, remova o máximo possível do tecido mole.
Enxágüe os ossos da perna com solução estéril de 10 mM PBS duas vezes para remover sangue em uma antena de seis centímetros. Mergulhe os ossos em um prato com 75% de etanol por três minutos e enxágue com PBS duas vezes. Armazene os ossos limpos em um tubo de centrífuga de 50 mililitros estéril com tubo PBS estéril a 80 graus Celsius.
Descongele os ossos congelados à temperatura ambiente e congele novamente a 80 graus Celsius por uma hora. Sujeitar os ossos a mais de dois ciclos de congelamento para lise celular e quebra tecidual. Em seguida, coloque os ossos em um tubo de centrífuga de 50 mililitros estéril cheio de 0,5 HCl normal e incubar durante a noite em temperatura ambiente em um agitador orbital com agitação suave para garantir a cobertura completa e uniforme dos ossos.
Após a decalcificação, decante a solução de ácido clorídrico completamente e enxágue os ossos em água corrente por uma hora. Em seguida, use água destilada para lavar os ossos duas vezes por 15 minutos por lavagem em um agitador orbital. Decante a solução completamente.
Para extrair os lipídios em um osso desmineralizado, coloque os ossos em um tubo de centrífuga de 50 mililitros com uma mistura de 1:1 de metanol e clorofórmio. Enrole o tubo com papel alumínio para evitar a luz para prevenção da decomposição do clorofórmio. E coloque o tubo em um agitador orbital por uma hora.
Em seguida, use pinças para transferir os ossos para outro tubo de metanol com papel alumínio por 30 minutos. Remova o metanol completamente e lave com água destilada duas vezes por 15 minutos em um agitador orbital. Decante a água de lavagem final e prossiga sob condição estéril.
Enxágüe os ossos em um prato de seis centímetros com PBS estéril por três minutos. Adicione 40 mililitros de solução estéril de 0,05% TE em um tubo de centrífuga de 50 mililitros e incubar ossos por 23 horas em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius. Descarte a solução TE e enxágue duas vezes com PBS estéril suplementado com ampicillina de 90 g/mL e kanamycina de 90 g/mL por 15 minutos cada no agitador orbital.
Depois de decantar completamente a lavagem final, reabastecer novamente com 40 mililitros de PBS estéreis com antibióticos. Lave bem por 24 horas em temperatura ambiente com agitação suave para conseguir uma esterilização eficaz de espaços porosos. Em seguida, transfira os ossos para um tubo de centrífuga de 50 mililitros cheio de PBS estéril com antibióticos.
A Matriz Extracelular Óssea preparada pode ser armazenada a quatro graus Celsius por dois meses. Mergulhe BEM em 75% de etanol em um prato e agite suavemente o prato à mão por 30 segundos. Em seguida, enxágue com PBS por 30 segundos, duas vezes.
Transfira o BEM para uma placa de cultura de seis poços limpa. Adicione dois mililitros de cultura completa a cada poço. Incubar o BEM durante a noite em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius.
Obtenha linhas celulares humanas em 100 microliters de PBS pré-aquecido contendo indicador de fenol vermelho. Use uma pipeta para suspender as células de SO com a concentração aproximada de 1 vezes 10 a 5. Após o BEM estar totalmente encharcado no meio, a partir de epífitas proximais ou distais, fure a agulha até a cavidade medular do BEM e injete células de OS no BEM.
Incubar o modelo OS-BEM por um mínimo de duas horas em uma atmosfera umidificada de 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius para garantir que as células injetadas aderam firmemente ao BEM. Em seguida, retire a placa da incubadora. Adicione um meio de cultura mililitro na placa, e mantenha-o na incubadora durante a noite para revestir completamente a superfície da cultura BEM.
Transfira suavemente o modelo OS-BEM para um novo poço de uma placa de seis poços com uma pinça estéril, e realimente um meio de cultura fresco mililitro. Cultura do modelo por 14 dias na incubadora. Durante a incubação de 14 dias, continue monitorando a cor média.
Se o meio se transformar em laranja, ou mesmo amarelo, refresque imediatamente o meio descartando metade do meio antigo e adicionando em novo meio para manter um ambiente saudável para as células de SO. Mantenha o estado da célula de monitoramento sob o microscópio de fluorescência invertida. Quando as células de SO se expandirem para a placa, transfira suavemente o modelo OS-BEM para outro novo poço com pinças estéreis.
Após 14 dias de cultura, enxágue suavemente o modelo OS-BEM com PBS para remover o meio de cultura. Em seguida, transfira para um tubo de centrífuga de 15 mililitros e adicione formalina 10% tamponada para fixar para identificação histológica. Após a desmineralização e descelularização, o BEM parece ser translúcido com maior resiliência e tenacidade em comparação com o osso do rato nativo.
Um pouco de resíduo muscular no espaço da cavidade medular pode ser claramente observado. A imagem de campo brilhante do osso nativo e do BEM descelularizado, mostra a remoção minuciosa dos núcleos celulares. A estrutura porosa natural no arranjo de rede de colágeno é bem mantida em BEM descelularizado.
Além disso, a coloração imunohistoquímica para colágeno I e colágeno IV mostra que os principais componentes da matriz extracelular são preservados na tíbia do rato após a descelularização. Durante os 14 dias de cultura, tanto o periosteum quanto o endosteum são infiltrados pela expansão das células de SO. As células de SO no BEM descelularizado apresentam morfologia altamente heterogênea semelhante às características citopatológicas de uma seção de SO.
A análise imunohistoquímica após a cultura no modelo BEM por 14 dias mostra grandes vantagens em culturas de longo prazo. Além disso, as células de OS e a cultura BEM, glicoproteína de matriz óssea altamente expressa, que é específica para a matriz osteoide. Este modelo tridimensional in vitro tem sido usado para demonstrar uma heterogeneidade fenotípica e um mecanismo regulatório de dediferente osteossarcoma com sucesso.
