Este protocolo é significativo, pois é a primeira vez que os dados transcriômicos dos mosquitos Anopheles Gâmbiae foram feitos livremente e de fácil acesso em um só lugar. Essa técnica permite que todos os pesquisadores, mesmo aqueles sem antecedentes em bioinformática, acessem livre e facilmente dados de expressão em seus genes favoritos e mosquitos resistentes a inseticidas. Para começar, siga o link na parte inferior da página do projeto LSTM IR-TEx para executar o aplicativo IR-Tex Web em um navegador da Web.
Uma vez iniciada a página da Web, clique no botão Aplicativo na parte superior da página, que exibirá o aplicativo e as saídas associadas. Leia cada saída relacionada à entrada padrão na caixa de ID de transcrição. Selecione condições e conjuntos de dados Anopheles Coluzzii expostos a inseticidas piretróides, ou não expostos a qualquer classe de inseticida e transcrições associadas com um coeficiente de correlação superior a 0,98.
Para explorar a expressão de uma transcrição de interesse, primeiro selecione a transcrição. Em seguida, insira o ID de transcrição na caixa de ID de transcrição, lembrando que as transcrições terminam em RX dependendo da isoforme de interesse. Selecione os conjuntos de dados para interrogar, levando as caixas relevantes para os países, incluindo status de exposição, espécies de interesse e classe de interesse de inseticidas.
Certifique-se de que esses critérios resultem em um conjunto de dados incluído. Clique em Exibir atualizações na parte inferior do menu de seleção ou pressione Return, ignorando o valor absoluto de correlação por enquanto. Dê tempo ao aplicativo para atualizar.
Seja o primeiro gráfico tem a Mudança de Dobra Log2 entre uma população resistente, e uma população de mosquito suscetível em laboratório da transcrição de interesse, em cada conjunto de dados que atende aos critérios selecionados. Leia as informações abaixo do gráfico como as alterações da dobra entre os mosquitos resistentes e suscetíveis para cada conjunto de dados relevante, além dos valores P ajustados associados. Cada linha representa sondas individuais na micro matriz.
Leia a tabela adicional abaixo, como o número de experimentos em que a transcrição de interesse é significativa, bem como o número total de experimentos que correspondem aos critérios selecionados. Para baixar os dados em formato separado da guia, clique no botão Baixar sob as duas tabelas. Isso permite que o usuário explore os dados de forma mais fácil, usando um programa como o Excel.
Cada ponto no mapa representa os locais aproximados de coleta de mosquitos resistentes em cada conjunto de dados, em que a transcrição de interesse é expressa diferencialmente. As cores seguem um sistema de semáforos que é explicado no aplicativo. Salve as saídas gráficas clicando com o botão direito do mouse, clicando em Salvar a imagem Como e escolhendo uma pasta apropriada.
No caso de um erro de saída pelo aplicativo, é provável que nenhum conjunto de dados corresponda aos critérios inseridos. Correlações dos padrões de expressão de transcrições em vários conjuntos de dados podem ser usadas para prever a função de transcrição e potencialmente elucidar transcrições co-regulamentadas do mesmo caminho. Antes de clicar em Update View, mova o controle deslizante de valor de correlação absoluta para 0,85 e clique em Atualizar exibição ou pressione Retornar.
Examine a Tabela de Correlação para encontrar as múltiplas transcrições que agora são exibidas e estão correlacionadas com a entrada e transcrição. Leia a tabela abaixo da saída gráfica, que contém o valor de correlação de cada transcrição. Para baixar os dados em um formato separado por guias, clique no botão Baixar.
Manipule o controle deslizante de valor de correlação absoluta e observe quaisquer alterações na parte inferior mais grafia e tabela. Uma corda mais baixa do valor da correlação mostrará mais transcrições, mas introduzirá mais ruído. Uma vez instalado o IR-TEx, abra o Arquivo de Codificação Suplementar RStudio1 e execute cada linha para configurar o sistema para IR-TEx.
Uma vez que todos os pacotes sejam instalados e atualizados com sucesso, vá para File, Open. Localize IR_TEx. r, destaque e aberto.
Isso agora deve ser visível na janela superior do RStudio. Para executar o aplicativo, pressione o botão Executar app no canto superior direito da janela. Uma segunda janela aparecerá na qual o aplicativo será carregado.
Uma vez que o carregamento esteja completo, para a funcionalidade completa, clique em Abrir no Navegador, localizado no canto superior direito da janela carregada. O usuário pode adicionar novos conjuntos de dados de resistência ao IR-TEx gerados usando o array Anopheles Gágeiae 15k Agilent, conforme descrito no protocolo TEx. Abra arquivo adicional2.txt.
Este arquivo de busca de RNA representa o modelo no qual novos dados devem ser baseados. A coluna A é identificador, a coluna B é a troca de dobras crua e a coluna C é o valor P ajustado. Execute o código R para corresponder aos identificadores em um único arquivo delimitado por guias em todas as plataformas e, em seguida, organize e normalize os dados.
As instruções estão contidas no arquivo. Qualquer caminho de arquivo será separado por uma barra para a frente para Mac OS ou uma barra dupla para a frente para o Windows. Faça backup do arquivo original.
Saída o arquivo produzido no final do Arquivo de Revestimento Suplementar2 para um local de escolha para uso na próxima etapa. O Arquivo de Codificação Suplementar2 produzirá um novo Fold_Changes. arquivo txt.
Execute o código contido no Arquivo de Codificação Suplementar3. Encontre o arquivo de saída chamado FC_DistribPlot. png na pasta especificada como caminho de arquivo.
Verifique as distribuições do Log2 Fold Change para verificar se as distribuições log2 Fold Change são quase idênticas entre os conjuntos de dados. Aqui é mostrada a expressão mRNA de GS TMS1 e AGAP 009110 RA em duas populações anopheles coluzzii multi-resistentes de Cote d'Ivoire, e Burkina Faso, respectivamente. A comparação com o laboratório suscetível Anopheles Coluzzii N-Guzo revelou que essas transcrições são significativamente reguladas em duas populações multi-resistentes separadas.
A derrubada induzida pelo RNA-I foi realizada em mosquitos da colônia T-Oscillae do laboratório LSTM. Esta colônia é originária da Costa do Marfim, e é resistente a todas as principais classes de inseticida utilizadas na saúde pública. A atenuação da expressão de GS TMS1 resultou em um aumento significativo da mortalidade, após a exposição delta matheran, em comparação com os controles injetados gfp, demonstrando a importância desta transcrição na resistência pireretóide.
Por outro lado, a queda da AGAP 009110 RA não resultou em nenhuma mudança significativa na mortalidade após a exposição. O GST MS1 foi significativamente mais expresso em 20 dos 21 conjuntos de dados de micro array disponíveis para essas espécies. Em cada local, a Mudança do Fold foi significativamente maior na resistência, em comparação com as populações suscetíveis.
Todos os conjuntos de dados são de diferentes experimentos ao longo de vários anos, e não foram projetados para uma abordagem limpa baseada em microanálise, por isso pode ser necessário reduzir a stringency de valor P normal. Outra avaliação de knock down fenotípica pode ser realizada com outros inseticidas, e traços da história da vida. Se houver resultados suficientemente bons, a parasitização a jusante pode determinar o papel da proteína.
Esta técnica é o primeiro aplicativo para integrar dados transcriômicos sobre a resistência a inseticidas do complexo de espécies Anopheles Gâmbiae e disponibilizá-los a todos os pesquisadores deste campo.
