Este protocolo é significativo porque fornece uma abordagem geral para sistemas de dimerização de proteínas de engenharia como biosensores para uma variedade de moléculas pequenas. Além disso, utiliza uma biblioteca de proteínas altamente diversificada para selecionar biosensores para diferentes ligantes de forma eficiente e econômica sem a necessidade de equipamentos especializados. O biosensor projetado pode ser usado para controlar quimicamente o comportamento celular e monitorar mudanças em tempo real em metabólitos celulares.
Através dessa demonstração visual, os pesquisadores podem observar uma instrução detalhada das técnicas com uma clara expectativa da produção experimental. Comece cada rodada de seleção cultivando uma única colônia celular com capacidade para eletroporação TG1 em seis mililitros de meio 2YT a 37 graus Celsius e 250 revoluções por minuto para uma absorvência de 600 nanômetros de aproximadamente 0,5. Quando a densidade óptica ideal for atingida, coloque as células no gelo.
Para preparar as contas de seleção negativas, lave 300 microliters de contas magnéticas revestidas de streptavidin três vezes com um mililitro de 05%PBS mais tampão Tween e duas vezes com um mililitro de PBS por lavagem em um rack de separação magnética. Resuspenque as contas com um mililitro de 1% de caseína na PBS, e satura as contas com biotina em cinco vezes a capacidade de ligação relatada das contas. Depois de uma hora em temperatura ambiente com rotação, lave as contas cinco vezes com PBS mais Interpol e três vezes com PBS como demonstrado.
Após a última lavagem, adicione aproximadamente uma vez 10 às 13 partículas de phage em 1%de caseína e 1% de albumina de soro bovino na PBS às contas para uma incubação de uma hora em temperatura ambiente com rotação. No final da incubação, transfira o supernante para um tubo de 1,5 mililitro. Para seleção positiva com as contas de ligadura biotinylated streptavidin, saturar metade do volume de contas utilizadas para a seleção negativa no ligante biotinilado de escolha em cinco vezes a capacidade de ligação total calculada de acordo com o manual.
Depois de uma incubação de uma hora em temperatura ambiente com rotação, lave as contas cinco vezes com PBS mais Tween e três vezes com PBS sozinho como demonstrado, e bloqueie as contas com um mililitro de 1%de caseína e 1% de gânreo bovino por uma hora com rotação. No final da incubação, lave as contas magnéticas revestidas de streptavidin três vezes em PBS mais Tween e uma vez só na PBS, como demonstrado, e use phage não vinculado para resuspendar as contas magnéticas revestidas de streptavidin. Extrair o supernante contendo phage sem perturbar as contas, e reserve a amostra para ser usada como entrada.
Em seguida, lave as contas 10 vezes com PBS mais Interpolação e cinco vezes com PBS como demonstrado, transferindo as contas para um novo tubo após cada três lavagens para evitar a ligação inespecífica dos phages ligados às paredes do tubo. Para aumentar competitivamente as phages vinculadas, adicione 450 microliters de uma concentração micromolar de ligante não biotinínado às contas positivas de seleção, e coloque as contas em rotação por 30 minutos. No final da incubação, transfira o supernante para um novo tubo para ser usado como saída.
Para titulação de entrada, prepare 10 diluições seriais em PBS até uma vez 10 a 9 vezes com a phage de entrada. Transfira 10 microliters de phage de entrada de uma vez 10 para as sete para 10 para as nove diluições para 70 alíquotas microliteres das células TG1 preparadas. Após 45 minutos a 37 graus Celsius, coloque as células TG1 infectadas em pratos individuais de 90 milímetros de 2YT contendo 100 microgramas por mililitro de ampicillina e 2% de glicose para uma incubação noturna a 37 graus Celsius.
Na manhã seguinte, use a fórmula para calcular a entrada de phage. Para infecção de saída e titulação, adicione as pragas elucidadas a três mililitros de células TG1 para uma incubação de 45 minutos em um banho de água Celsius de 37 graus. Em seguida, prepare 10 diluições seriais das células infectadas em meio 2YT fresco até uma vezes 10 para a terceira concentração, e emplaque cada diluição em pratos de ágar 90 milímetros 2YT para sua incubação noturna a 37 graus Celsius.
Na manhã seguinte, calcule a produção de phage de acordo com a fórmula. Para isolar os clones individuais de uma sublibraria enriquecida, transfira colônias únicas das placas de células TG1 cultivadas durante a noite em 250 microliters de meio 2YT suplementados com ampicillina por poço em placas estéreis de poço profundo para sua cultura noturna a 37 graus Celsius. Quando as células atingirem uma densidade de 600 nanômetros de aproximadamente 0,5, adicione cinco vezes 10 às nove unidades formadoras de placas por mililitro de ajuda CM13 para cada poço, e incubar as células por 45 minutos a 37 graus Celsius a 250 rotações por minuto.
Ao final da incubação, adicione 500 microliters de meio 2YT suplementados com ampicillina e 50 microgramas por mililitro de kanamicina em cada poço, e coloque a placa a 25 graus Celsius e 250 rotações por minuto durante a noite. Na manhã seguinte, sedimente as células por centrifugação para permitir a coleta das partículas de phage. Para validar a ligação âncora por ELISA, cubra placas ELISA de 96 poços com 100 microlitadores de cinco microgramas por mililitro streptavidin em tampão de revestimento a quatro graus Celsius durante a noite.
Na manhã seguinte, lave as placas três vezes em 300 microliters de PBS mais Tween antes de adicionar 100 microliters de um alvo biotinína de um micromolar aos poços alvo e 100 microliters de biotina de um micromolar ou holog de alvo aos poços de controle apropriados. Após uma hora em temperatura ambiente, lave as placas cinco vezes com PBS mais Interpol por lavagem, e bloqueie qualquer ligação inespecífica com 300 microliters de 1% de caixa por poço durante uma hora a temperatura ambiente. No final da incubação, lave as placas três vezes em PBS fresco mais Interpol por lavagem, e adicione o supernatante de phage purificado.
Depois de uma hora em temperatura ambiente, lave as placas 10 vezes com PBS fresco mais Interpolação por lavagem. Adicione 100 microliters de rabanete peroxidase M13 anticorpo proteico de casaco principal a cada poço para uma incubação de uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, lave as placas três vezes como demonstrado e adicione 100 microlitadores de substrato TMB a cada poço para uma incubação de 10 minutos à temperatura ambiente ou até que uma mudança de cor visível seja observada.
Em seguida, pare a reação com 100 microliters de ácido clorídrico de um molar por poço, e leia a placa a 450 nanômetros em um espectrofotômetro. Após a validação da aglutinante âncora, a triagem do aglutinante de dimerização também deve ser realizada usando a mesma biblioteca de proteínas voltada para o complexo de ligadura âncora. Resultados típicos de enriquecimento após quatro a seis rodadas de seleção são uma boa indicação de que há uma alta proporção de acertos potenciais nas sublimbraries, nesse caso, outras rodadas de seleção podem não ser necessárias.
O único clone ELISA é adequado para analisar a afinidade relativa de ligação e seletividade de pastas de âncora e dimerização e facilita a comparação da seletividade de ligação entre clones. Da mesma forma, a seleção de aglutinante de dimerização permite a identificação de clones que formam um heterodimer com o aglutinante de âncora imobilizado apenas com ou sem o ligante. Esses dados de ligação dependentes de concentração de ligantes sugerem que os nano corpos testados são adequados para a construção de um sistema de dimerização quimicamente induzido em comparação com a baixa ligação demonstrada pelas amostras de controle.
Além disso, a cromatografia analítica de exclusão de tamanho pode ser usada para confirmar a formação do heterodômero entre as pastas âncora e dimerização na presença do ligante. Por exemplo, neste experimento, observou-se um pico de dimerização quando as pastas de ancoragem e dimerização e canabidiol foram misturadas. Em contraste, nenhum pico de dimerização foi detectado na ausência de canabidiol ou quando cada aglutinante foi carregado apenas para a coluna.
O sistema de dimerização de proteínas deve ser geneticamente codificado em leveduras ou células mamíferas para permitir uma verificação adicional dos biosensores selecionados para o desenvolvimento de aplicações in vivo. Esperamos que este método dê a outros pesquisadores as ferramentas eficazes e necessárias para detectar metabólitos importantes, moléculas de sinalização ou drogas in vivo com alta resolução esposteral.
