Este protocolo é o sistema autólogo para cultura de fibroblastos humanos com plasma rico em plaquetas do próprio paciente e preparo padronizado por cinco minutos. O PRP promove uma expansão celular maciça de fibroblastos em cultura. Eu recomendaria que você use este método usando PRP como um suplemento celular quando você precisa de riacho maciço e expansão celular segura para terapias celulares autólogas.
Quando você tenta esse protocolo, eu recomendo que você verifique a integridade do PRP. Seu plasma tem que ser muito limpo com ausência de glóbulos vermelhos. Quando você transfere, você tem que fazê-lo com muito cuidado.
E em relação à digestão do seu tecido, ele tem que estar muito limpo antes de prosseguir. Para começar, vire cuidadosamente os tubos de plasma rico em plaquetas cheios de sangue, ou PRP, de cabeça para baixo três vezes para misturar o sangue com anticoagulante. Centrifugar as amostras de sangue a 1500g por cinco minutos em um rotor fixo de 45 graus angulados e equilibrar os tubos.
Após a centrifugação, o sangue fracionado tem glóbulos vermelhos e brancos presos sob o gel separador e plaquetas na superfície do gel. Inverter suavemente o tubo de PRP 20 vezes para ressuspender o depósito plaquetário no sobrenadante plasmático. Certifique-se de que as plaquetas estão totalmente separadas do gel e que o plasma deve mudar de límpido e transparente para turvo.
Recolher a solução de plasma do tubo utilizando um dispositivo de transferência ligado a uma seringa de 10 mililitros. Coloque as amostras de pele em um tubo de polipropileno de 50 mililitros com PBS e agite o tubo suavemente. Se a amostra de pele for relativamente grande, coloque-a na tampa de uma placa de cultura de tecido de 150 centímetros quadrados com o lado epidérmico para baixo.
Remova o tecido adiposo subcutâneo usando uma pinça e tesoura. Para evitar que o tecido seque, lave o tecido a cada poucos minutos em PBS. Quando a remoção de gordura estiver completa, use um bisturi para cortar as amostras de pele em tiras, aproximadamente 0,5 por 1,5 centímetros.
Em seguida, adicione cinco mililitros de mistura de colagenase/dispase a um tubo estéril de 15 mililitros. Transfira o tecido cortado para o tubo. Certifique-se de que as peças de tecido estão submersas na solução e tampar o tubo com segurança.
Coloque os tubos em uma incubadora a 37 graus Celsius com agitação orbital por 150 minutos. Após a incubação, mova o tubo contendo o tecido para o gabinete de biossegurança. Coloque a tampa de uma placa de cultura estéril de 100 milímetros de cabeça para baixo no armário de biossegurança.
Transfira a suspensão de tecido para o fundo da placa de cultura de 100 milímetros sem respingar. Se algum pedaço de tecido permanecer no tubo, use uma pipeta estéril de um mililitro ou pinça estéril para transferir as peças para o fundo da placa de cultura. Com a epiderme voltada para cima, segure a derme com um par de pinças.
Segure a borda da epiderme com outro par de pinças e descasque a derme e a epiderme. Mantendo as peças separadas na mesma tampa, coloque as peças dérmicas em uma nova placa de cultura de 100 milímetros contendo PBS. Em seguida, utilizando pinça de laboratório, transferir as peças dérmicas para um tubo de polipropileno de 15 mililitros contendo três mililitros de PBS de tripsina 0,3%.
Incube o tubo em banho-maria de 37 graus Celsius e misture o conteúdo a cada dois ou três minutos, invertendo o tubo várias vezes. Após 10 a 20 minutos, pare a reação adicionando de três a cinco mililitros de meio de crescimento completo gelado. Vórtice o tubo vigorosamente várias vezes.
Filtre a suspensão, que contém os fibroblastos, através de uma malha de nylon de 85 mícrons em um tubo de 50 mililitros. Centrifugar a solução de fibroblastos a 150g durante 10 minutos. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 100 a 200 microlitros de meio de crescimento completo para contagem celular.
Plaquear as células em um frasco de cultura de tecidos de 25 centímetros quadrados. Em seguida, incubar o balão a 37 graus Celsius. Troque o meio que contém células não aderentes no dia seguinte e, novamente, a cada três ou quatro dias.
Quando os fibroblastos atingirem 70 a 80% de confluência, lave-os com PBS e adicione solução de tripsina-EDTA. Depois de incubar o balão durante três minutos a 37 graus Celsius, pare a reacção adicionando três a cinco mililitros de meio de crescimento completo quente. Em seguida, centrifugar a suspensão celular a 200g por cinco minutos.
Remover o sobrenadante por aspiração. Cultivar os fibroblastos em meio PRP e incubar a 37 graus Celsius. A densidade celular mínima recomendada é de 4.000 células viáveis por centímetro ao quadrado.
Um dispositivo médico dedicado foi usado para produzir PRP através do processamento de sangue total de 10 pacientes diferentes. O dispositivo removeu a maioria dos glóbulos vermelhos e glóbulos brancos. A concentração plaquetária média no PRP foi aproximadamente 50% maior que a concentração plaquetária no sangue total.
Fibroblastos autólogos foram cultivados em meio com SFB a 10% ou em meio com concentrações de PRP variando de um a 50% Após sete dias de cultivo, sem alterar o meio, as culturas submetidas a priming com 20% de PRP exibiram maior número de fibroblastos viáveis. O PRP teve efeitos potentes como impulsionador da proliferação até 7,7 vezes em comparação com a SFB. A coloração com faloidina mostrou que a alteração morfológica observada na ativação do PRP estava relacionada à reorganização da F-actina, que é uma assinatura da ativação dos fibroblastos.
Uma grande preocupação da rápida expansão celular é o risco de modificação genômica. Para avaliar isso, você pode realizar um ensaio de hibridização genômica comparativa para avaliar a estabilidade genômica de suas células. A principal vantagem dessa técnica é substituir a SFB por um PRP, que é um suplemento biológico autólogo mais potente.
Com isso, o pesquisador pode crescer mais células mais rápido sem qualquer adição de uma substância xenogênica. Podemos utilizar esta técnica para outros tipos celulares que necessitem de expansão ex vivo antes da aplicação clínica, por exemplo, queratinócitos ou células-tronco mesenquimais.
