As células mononucleares tonsilármais são mais relevantes e complexas do que as células sanguíneas, e seu isolamento permite o estudo da resposta das células imunes em patologias que envolvem imunidade mucosa. A técnica que estabelecemos permite a recuperação de um grande número de células imunes de um tecido mucosa, mantendo sua integridade para estudos ex vivo. O método é bastante simples, mas as amígdalas precisam ser tratadas rapidamente e com cuidado para maximizar o rendimento.
Transporte o tecido amísil humano para o laboratório, conforme descrito no texto do manuscrito. Em seguida, coloque o coador de células em um prato de cultura de 150 por 25 milímetros. Coloque todos os instrumentos de dissecção em outro prato para mantê-los estéreis.
Todos os seus principais espécimes devem ser tratados com cuidado, pois não foram previamente qualificados e podem conter agentes infecciosos. Em seguida, despeje o PBS do frasco em um coador, porque ele conterá algumas células que egressaram as amígdalas. Usando fórceps estéreis, transfira as amígdalas do frasco para o prato de cultura usando fórceps estéreis.
Se necessário, adicione mais PBS para imergir a grade. A dissecção levará cerca de 45 minutos por amígdala. É crucial que durante esse tempo as amígdalas estejam submersas para garantir uma boa viabilidade e rendimentos celulares.
Remova tecido cauterizado sangrento e miomado usando fórceps e um bisturi. Usando o bisturi e a pinça curva, corte o tecido em pequenos pedaços de menos de meio centímetro de diâmetro. Corte todo o tecido para que os pequenos pedaços possam ser imersos o tempo todo.
Coloque alguns pedaços de tecido no coador celular. Raspe-os na grade com um pilão de vidro até que apenas uma camada muito fina de estroma branco permaneça. Remova e descarte o estroma para evitar entupir a grade.
Em seguida, use uma pipeta de 10 mililitros para transferir a suspensão da célula para a grade e raspá-la uma última vez. Em seguida, use uma pipeta de 10 mililitros para transferir a suspensão da célula para um frasco estéril. Lave a grade e o coador de células com PBS uma vez, e transfira o PBS para o frasco também.
Antes de prosseguir deixe a suspensão do celular descansar no banco por cinco minutos em temperatura ambiente. Coloque uma peneira estéril de 70 micrômetros em cima de um novo frasco de 50 mililitros. Transfira suavemente a suspensão da célula para a peneira com uma pipeta de 10 mililitros.
Se a peneira estiver entupida, use a parte de trás de uma ponta de pipeta de um mililitro estéril para raspar as células através da peneira. Troque a peneira quantas vezes for necessário. Centrifugar as células a 250 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius.
Após a centrifugação, descarte o supernasce. Suspenda novamente a pelota tocando suavemente o frasco e, em seguida, suspenda novamente as células em 35 mililitros de PBS. Para completar a primeira fase do isolamento celular, coloque uma nova peneira de 70 micrômetros em cima de um novo frasco e transfira a suspensão celular para ele com uma pipeta de 10 mililitros.
Para obter uma solução celular mais clara, comece adicionando 15 mililitros de um gradiente de densidade ao novo frasco de 50 mililitros. Despeje a solução TMC em cima do meio de gradiente de densidade, tomando cuidado para minimizar a mistura. Em seguida, centrifufique a solução a 1000 vezes g por 30 minutos em temperatura ambiente com aceleração e freio desligado.
Depois de remover o frasco da centrífuga, use uma pipeta de 10 mililitros para remover e descartar a camada superior. Não perturbe a interface entre os TMCs e o meio gradiente de densidade. Em seguida, remova os TMCs com a ponta de pipeta de um mililitro e transfira-os para um novo frasco de 50 mililitros.
Para lavar as células, adicione primeiro 50 mililitros de PBS contendo soro bovino fetal de 2% e 2 milimilhas EDTA. Em seguida, centrifugar o tubo a 250 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Lave as células novamente, mas desta vez centrifugar o tubo a 400 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius.
Prepare o meio de cultura R10 suplementando o RPMI 1640 com FBS inativado por calor de 10%, 2 milimônios L-glutamina e a solução antibiótica. Suspenda os TMCs em 10 mililitros de R10. Então conte as células.
As células podem ser usadas imediatamente ou congeladas para uso futuro, conforme descrito no manuscrito. Os TMCs foram manchados, incubados com anticorpos e caracterizados por citometria de fluxo. Os TMCs continham todos os principais tipos de células imunes presentes em células mononucleares periféricas do sangue, abreviado PMBC.
No entanto, as frequências de todos os tipos de células, exceto células B, foram menores em TMCs do que em PBMCs. Para estudar a ativação celular na produção de citocinas, os TMCs foram estimulados durante a noite com resiquimod R848. Os TMCs, plotados em azul, produziram todas as citocinas testadas, exceto ifn Lambda 2/3 e IL-8, embora a produção fosse menor do que em PBMCs, plotadas em verde.
A dobra aumenta comparando a estimulação R848 com nenhuma estimulação é notada em vermelho. TMCs purificados e isolados, blocos de tecido azul e tonsilar, laranja, foram estimulados por 24 horas com o vírus influenza A, IAV. A produção de IFN foi detectada em TMCs, mas não no sobrenatante dos blocos teciduais indicando que as explantas teciduais não são o melhor modelo para o estudo da secreção de citocinas e ativação celular.
Após a pré-incubação com a droga tóxica C1 e estimulação com R848, TMCs e PBMCs foram avaliados para viabilidade. Os TMCs eram mais sensíveis ao C1. Isso sugere que novas drogas em tratamentos futuros devem ser testadas em células a partir de tecidos, não apenas em linhas celulares, PBMCs ou explants teciduais. Este procedimento nos permite usar os TMCs como PBMCs de sangues inteiros e realizar os mesmos experimentos celulares, como purificação de um tipo celular específico, cultura celular, citometria de fluxo ou congelamento.
Isolamentos de TMCs possibilitam caracterizar melhor, em um modelo relevante, a resposta imune em órgãos linfoides secundários em patologias que envolvem imunidade mucosa.
