O protocolo fornece uma maneira simples de estudar baratas americanas. Uma praga sanitária comum e um inseto benéfico para a medicina tradicional chinesa. Ajudará a explorar os mecanismos moleculares de múltiplas atividades de vida de baratas americanas derrubando genes específicos.
A principal vantagem desta tecnologia é que ela pode derrubar genes em baratas americanas ou outros insetos similares que não são adequados para a edição de genes. Essa tecnologia pode ser usada para explorar vários campos, como a regulação genética e epigenética, processo de desenvolvimento de tecidos, regeneração de apêndices, comportamento de acasalamento e outros lados interessantes da barata americana. Esta tecnologia é fácil de operar e versátil.
Sugerimos manter os animais saudáveis durante o tratamento de injeção de DSRA. Acredito que os novatos podem facilmente dominar essa técnica depois de várias sessões de treino. Para começar, separe as ninfas eclodidas da oothecae com uma peneira de abertura de quatro milímetros.
Escolha o P.americana recém-maltado branco com um tubo de vidro. Coloque o P.americana em novos recipientes e aguarde o estágio correto para o tratamento. No sistema de reação, adicione 10 microliters de tampão T7 2X, 2 microliters do T7 Express Enzima Mix e dois microgramas de produto PCR.
Finalmente, compõem o volume total para 20 microliters com água dupla destilada. Misture suavemente de cabeça para baixo manualmente e incubar a 37 graus Celsius por 30 minutos, depois 70 graus Celsius por 10 minutos. Diluir 4 microgramas por microliter RNase Uma solução com água DEPC a uma razão de 1 a 200.
Em seguida, adicione 1 microliter de uma unidade por microliter RQ1 RNase Free Dnase e 1 microliter de solução RNase A diluída ao sistema. Incubar a 37 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, adicione 10% do volume total de acetato de sódio e três volumes do volume total de isopropanol.
Misture suavemente de cabeça para baixo manualmente, em seguida, coloque no gelo por cinco minutos e centrífuga a 13.000 g por 10 minutos a 4 graus Celsius. Remova o supernatante com uma pipeta. Em seguida, lave o resíduo com 75% de etanol, com 25% de água tratada DEPC, depois centrífuga a 13.000 g por 5 minutos a 4 graus Celsius.
Retire o supernasce novamente, o ar seque a pelota por 15 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, dissolva o RNA duplo encalhado com cerca de 100 microlitres de água DEPC e dilui-o para a concentração final de 2 microgramas por microliter. Configure o programa na bomba de microinjeção para garantir que o volume de cada injeção seja consistente.
Em seguida, limpe a seringa enchendo-a com água DEPC 8 a 10 vezes. Instale a seringa de 10 microliter na bomba de micro injeção. Em seguida, inicie a bomba e encha a seringa com 10 microliters de solução RNA duplamente encalhada.
Anestesiar as baratas com dióxido de carbono, depois pegá-las suavemente com pinças e entregar a barata em direção à agulha à mão. Em seguida, insira a agulha através da lacuna entre dois somitas abdominais horizontalmente contra a epiderme. Injete a solução de RNA duplamente encalhada na barata garantindo que a ponta da agulha esteja o mais próxima possível da epiderme para evitar danificar órgãos internos.
Finalmente, puxe a ponta da agulha. Coloque as baratas injetadas em recipientes limpos de bioensaio. Espere cerca de 10 a 20 minutos para deixá-los se recuperar dos efeitos do dióxido de carbono.
Rotule os recipientes com a data de injeção, tipo e dose de RNA duplo encalhado e idade do P.americana. Ddc ou DOPA decarboxilase e Dpp ou genes decapentagáicos foram selecionados como dois exemplos para observar o fenótipo das baratas malteadas após injeção dupla de RNA encalhada e dsMocK que não tem alvo nos animais foi tomado como um controle negativo. A eficiência rnai foi detectada pelo QRT PCR.
Os genes foram significativamente derrubados com um valor P inferior a 0,01 para dsDdc e menos de 0,05 para dsDpp. P.americana com genes Ddc knockdown teve a epiderme branca devido à melanização bloqueada. No experimento com injeções de dsDpp, o RNAi interrompeu a regeneração dos membros.
Os insetos devem ser saudáveis e injetados sem danos. Esta tecnologia fornece uma maneira simples de explorar funções genéticas para insetos que não podem ser editados por genes, como barata americana.
