Agradecemos Hyewon Cooper para ilustrações.

1. Dissecação Solução salina Barata utilizado ao longo deste protocolo tem a seguinte composição: Solução salina Barata 36: (gramas por 100 mL) 210 mM de NaCl (1,227 g) KCl 2,9 mM (0,0216 g) 1,8 mM de CaCl 2 (0,0265 g) 0,2 mM de NaH 2 PO 4 • 2H 2 O (0,0032 g) 1,8 mM de Na 2 HPO 4 • 7H 2 O (0,0483 g) (PH 7,2. Ajustar o pH com NaOH 1 M ou HCl a 1 M). <ol><li> Seleccione uma barata macho do reservatório de retenção que tem cercos robusta (Figura 1). Os últimos segmentos do macho são estreitas em comparação com o sexo feminino, e que não contenham ovários e massa de ovos, os machos são mais fáceis de dissecar. Os machos de P. americana tem um par de curto pontas entre os cercos. Estas pontas não são observadas nas fêmeas. </li><li> Corte as asas, pernas e cabeça e prender o corpo, ventral voltada para cima, para um dish forrado com elastômero de silicone. </li><li> Com uma pinça pegar as placas ventrais e cortá-los com tesoura fina, começando na extremidade posterior e trabalhando anteriormente. Sempre mantenha os órgãos internos úmido com solução salina, enquanto tenta manter o cerci seco. Pode-se utilizar a cera ou peças de borracha para posicionar o abdómen para cima para impedir que a solução salina de molhar a cercos. Se eles não se molhar, seque-os com um pedaço de papel de seda. Empurre para o lado os órgãos internos e da substância branca (gordura corporal). A VNC é no centro do campo, corre o comprimento do abdómen e deve ser visível entre a traqueia brilhante. O cordão nervoso é translúcido e pode inicialmente ser difícil ver até que a iluminação é ajustada corretamente (Figura 2). NÃO manuseie a VNC com fórceps ou pinos de insetos, em vez disso manipulá-lo usando sondas de vidro. </li><li> Limpar sistema de traquéias do animal da melhor forma possível a partir do cordão nervoso com uma pinça e com um par de necessidade vidro finoles, dividir com muito cuidado os conectivos VNC longitudinalmente entre A6 e A5 ou A5 e A4 gânglios (Figura 3). Berço cercos a barriga para cima e para fora do banho de solução salina com pinos de insectos encurtadas e cera ou uma cunha de elastómero de silicone que pode ser cortado para se ajustar à preparação (Figuras 4A e B). Tenha cuidado extra no último segmento abdominal para não danificar os nervos Cercal que se projetam para o gânglio (Figuras 2D e 5). </li></ol> 2. Gravação Extracelular <ol><li> A preparação de microscópio, e aparelho de registo dissecados deve ser configurado no interior de uma gaiola de Faraday para bloquear particularmente AC, campos eléctricos externos, que podem substituir os sinais a partir dos neurónios (Figura 6). </li><li> Posicionar o microscópio de modo que ela é com vista a platina do microscópio. Uma vez que a preparação é colocada sobre o palco, ajustar a posição do feixe de alta intensidade do iluminadorpara melhor visualização do mesmo. </li><li> Ligue o amplificador diferencial AC / DC para a unidade de gravação de dados integrado (detalhes sobre as configurações de hardware e software específicos foram descritos anteriormente 25). O estágio de cabeça segurando um eletrodo de sucção deve ser conectado ao amplificador. Um fio de terra de prata que tenha sido revestido com Cl - inseridos nos resultados abdómen em gravações mais estáveis. A razão é que se a solução na cavidade do corpo não se encontra em contacto com o fluido do banho no prato, o fluido associada com o eléctrodo de gravação permanece ligado à terra. </li><li> Defina a frequência de gravação para 4 kHz. Definir a escala de tensão (eixo-y) a 500 mV (este pode ser ajustado para optimizar a visualização do traçado). Execute o software de gravação em modo contínuo ou osciloscópio para gravar a atividade neural em resposta a estímulos. </li><li> Corte um dos conectivos VNC perto de A5 e coloque a extremidade cortada ligado a A6 em um eletrodo de sucção. Certifique-se de pull solução salina no eletrodo de sucção para cobrir o fio de prata dentro dele antes de sugar no nervo. </li><li> Com uma pipeta de sopro de ar seco sobre os cabelos localizadas em cada cercus. Veja se estimular os cabelos na ipsilateral cercus ao conjuntivo gravado dá uma resposta diferente do contralateral. Tomar nota da amplitude das respostas e o número de espigas em um determinado intervalo de tempo durante o estimulação. </li><li> Mova o eletrodo de sucção a um nervo Cercal para a gravação. Para obter um melhor ajuste, mude para uma ponta do eletrodo com uma abertura menor, se necessário. </li><li> Corte o nervo perto do Cercal a A6 e, em seguida, sugar o nervo levando à cercus. Deve haver queima espontânea de potenciais de ação. Agora, soprar ar sobre o cercus e anotar as respostas. </li></ol> 3. Estimular eletricamente os nervos sensoriais para determinar Recrutamento <ol><li> Altere o software de gravação de modo a varrer para que ele grava traços (100-500 msec.) cada vez que um estímulo é acionado. </li><li> Ligue o eléctrodo estimulante para a saída do estimulador. </li><li> Conecte o cabo de estimulador com os dois terminais mini-gancho ou clipes. </li><li> Ligue a saída de disparo BNC do estimulador para a entrada de disparo na unidade de gravação. </li><li> Os seguintes parâmetros de estimulação deve evocar uma resposta: Duração: 0,3 s; Atraso: 10 ms; Freqüência: 1 Hz; Tensão: ajustar conforme necessário para obter um sinal nas gravações (pouco mais de limite e ser capaz de obter uma resposta máxima). Não há nenhuma razão para ir a tensões muito mais altas que o limite máximo para o recrutamento como de alta tensão pode ser prejudicial para o nervo. </li><li> Corte o nervo Cercal como distal possível, para que a raiz do nervo longo pode ser puxado para o eletrodo de sucção estimulante (Figura 7, cabeça de seta). O conjuntivo entre A6 e A5 ou outro segmento mais anterior pode ser usado. </li><li> Coloque o eletrodo de sucção de gravação para que você possa puvou-se um conectivo corte para o eletrodo. Certifique-se de puxar alguma solução salina para os eletrodos de sucção para cobrir o fio de prata dentro dele antes de sugar nos nervos. Certifique-se o eletrodo estimulando também é fundamentada no banho de solução salina (no abdômen perto A3 é ideal). </li><li> Entregar uma série de estímulos individuais de aumento da tensão até que um potencial de ação é exibida na tela. Deve-se fazer um registro da tensão estimulante mínimo e duração de recrutar uma resposta. Aumentar a intensidade até que uma resposta sináptica nas conectivos é observada. O grande pico (APs extracelulares) dos axônios gigantes aparece em primeiro lugar, em seguida, outro menor de AP também podem ser observadas. </li></ol>

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Os autores declaram que não há conflitos de interesse.

Uma das razões para as técnicas exibindo para esta preparação clássica é que o sistema cerci foi e ainda é uma área ativa de pesquisa na abordagem de questões de desenvolvimento de circuitos neurais, bem como questões relacionadas com a reparação e regeneração sináptica 26-31. Qualquer um dos métodos de actividade de evocar no cordão nervoso ventral barata pode ser usado para examinar os efeitos de agentes farmacológicos ou de insecticidas na função do sistema nervoso. Estas experiências são feitas simplesmente por dissolução de produtos químicos neuroactivos em solução salina. Depois de trocar esta solução com o meio banho normal, mudanças na atividade evocada ou espontâneo pode ser observado durante a gravação de conectivos ou um nervo motor para dar uma leitura consistente do efeito da substância química em função do SNC. Como em todos os experimentos neurofisiológicos um problema comum é o ruído elétrico. Provavelmente, o fator mais importante na qualidade de sinal para esses preparativos is a vedação do eléctrodo de sucção sobre o tecido nervoso. Um selo apertado que não chamar completamente no nervo Cercal ou conjuntivo é o ideal. Gravações também pode ser feita com eléctrodos de gancho duplos colocados sob o cordão nervoso e isolamento do VNC com uma mistura de óleo mineral e vaselina. A mistura pode ser carregada para uma seringa e expelido em torno do cabo de nervo 32. Também dissecação cuidadosa é tão crítico como aqui em qualquer preparação do SNC. Alguns podem achar que é mais fácil de acessar o CNS dissecando a cutícula dorsal. Enquanto isto reduz a possibilidade de danificar o cabo nervoso ventral pode ser mais difícil de remover todas as vísceras utilizando esta abordagem. Não é descrito aqui, mas esta preparação é passível de gravação intracelular nos interneurónios gigantes 32,33. O cordão nervoso inteiro também pode ser removido para acomodar vários gravação e estimulantes eletrodos simultaneamente. Na verdade exploração do lobo antenal, bo cogumelody, e outras estruturas anteriores do sistema nervoso central ainda está em andamento 34-35. Enquanto a barata CNS continua a lançar luz sobre investigação neurobiológica moderno esta preparação especial é simples o suficiente para ser usado em laboratórios acadêmicos de graduação.

Existem mais de 4.000 espécies de baratas, mas apenas cerca de 30 são pragas domésticas. Talvez o mais reconhecido é o misnamed barata americana Periplaneta americana que teve origem na África, e agora é encontrada em quase toda parte do planeta. Além de sua rápida velocidade de corrida e um comportamento evasivo, nos trópicos P. americana é capaz de 2,3 vôo. As características predominantes do sistema nervoso central barata (CNS) são a sua natureza segmentada ea descentralização do controle processa 4,5. O cérebro, torácica, abdominal e gânglios são unidos por conectivos interganglionic emparelhados para formar o cordão nervoso ventral (VNC). Os gânglios em cada segmento estão integrando centros. Eles são compostos de, uma região cortical exterior contendo células responsáveis ​​pela barreira de permeabilidade hemato-encefálica logo abaixo deles, eo somata de neurônios originar, em que o gânglio. Estes somata pode pertencer a interneurônios, neurônios moduladores, ou neurônios motores. Eles fornecem os axônios que permanecem dentro do gânglio de origem (interneuron local) ou axônios que se projetam entre os gânglios do sistema nervoso central (interneurons interganglionic) ou que terminam em células musculares periféricos (neurônios motores). A maioria somata estão posicionados ventralmente ou ventrolaterally no córtex ganglionar 5. Os pares, conectivos interganglionic conter apenas axônios e não corpos celulares neuronais. O neuropil de um gânglio contém células da glia (glia), folhetos axônio, feixes de axônios e dendritos, (neurites) de neurônios. O neuropil é desprovido de corpos celulares neuronais. Esta é a região dentro do gânglio onde ocorrem comunicação sináptica direta entre as células nervosas e integração de entradas. A capacidade da barata americana P. americana para detectar e de repente responder a um predador que se aproxima (pé, hand, etc.) tem sido atribuída a um circuito de reflex que consiste em cercos a 6,7 e o sistema de fibra gigante. O cercos são um par de estruturas, sensível ao vento dos sopros localizados na extremidade do abdómen (Figura 1). Em P. americana na superfície ventral de cada cercus contém cerca de 200 filiformes (thread) cabelos que estão organizados em 14 colunas. Nove destes colunas pode ser identificado de forma consistente em animais diferentes de acordo com as propriedades de resposta da célula do receptor associado e axónios. Cada cabelo é em um soquete que permite dobrar mais facilmente em um plano que é específico da coluna. Movimento dos cabelos em uma direção ao longo de seu avião induz uma despolarização da célula receptora e uma rajada de potenciais de ação (APs) no neurônio sensorial. Movimento na direção oposta inibe qualquer APs espontâneos em curso 8. O plano de deflexão preferida e direccionamento da resposta é diferente em cada coluna. Assim, o filiforcomplexos de receptores cabelo m são responsáveis ​​não só para detectar o movimento do ar, mas também para &quot;codificação&quot;, na forma de pontos de acesso, a direção da qual a corrente de ar originou. O processamento desta informação por parte do CNS resulta em um &quot;adequado&quot; resposta de fuga 6,7. Esta especificidade funcional, colunar dos pêlos sensoriais são preservados de animal para animal. A célula receptora de cada cabelo filiforme é responsável pela transdução do deflexão mecânica do cabelo num evento neural (resultando numa explosão ou a inibição de AP em axónios de células do receptor de 9. Os APs viajar para o gânglio abdominal do terminal (A6), através de cercal XI nervo, onde sinapse com os axônios gigantes do cordão nervoso ventral (VNC). Os axônios gigantes se acredita ser responsável pela transmissão e excitação subseqüente de neurônios motores que resulta em um comportamento de fuga 6,10,11. O comportamento de latência of a resposta de fuga de P. norte americana é uma das mais curtas de qualquer animal 7. Latência Comportamental é o tempo entre a chegada de um estímulo de um mecanorreceptor e o início de uma resposta de fuga. Em experimentos com cinematografia de alta velocidade para gravar a tentativa de fuga de um sapo de ataque, a barata foi observada para começar sua vez longe do sapo em cerca de 40 ms (tempo de início de extensão língua para barata movimento 7,12. Usando sopros de vento controlados , a latência de comportamento pode ser reduzida a 11 mseg. Outras experiências demonstraram que uma velocidade de vento de sopro mínimo de 12 mm / ms (com uma aceleração a 600 mm / ms 2) pode evocar uma resposta de fuga, ao passo que as velocidades ainda mais baixas (3 mm / seg) causou caminhando lentamente baratas parar de se mover 12. A forte correlação que normalmente existe entre os sistemas de fibras gigantes e comportamento de fuga tem sido bem documentada 13,14. Em instlhos, em que é necessária e suficiente para provocar um comportamento particular uma célula em particular, a célula é referido como um neurónio de comando 15,16. Interneurons Gigante (IG) no circuito de fuga vento de P. americana não são necessárias para a reflex. Os animais que têm experimentalmente cauterizado soldados ainda exibem o comportamento de fuga, portanto, esses soldados não são considerados neurônios de comando 17,18. Cortando conectivos cervicais que são rostral ao circuito sensório também influencia o comportamento, o que indica que a entrada descendente a partir do cérebro tem um efeito sobre a direcção de evacuação 19. Esses aspectos do controle fino e redundância são fundamentais para a sobrevivência do organismo e são complementadas por modulação neuroquímica via aminas biogênicas 20. O P. preparação cordão nervoso americana tem sido um sistema modelo elegante para neuroethologists nos últimos muitas décadas começando com o trabalho pioneiro de Roeder &lt;sup&gt; 21. Ele permite que os alunos de gravar, exibir e analisar a atividade sensorial primário e as respostas resultantes por interneurônios gigantes para sua 22,23,24 entrada. Além de transmitir a idéia de que os circuitos neurais subjacentes identificáveis ​​respostas comportamentais ao meio ambiente, estes exercícios devem incutir uma apreciação para as contribuições biológicas feitas por esta praga comum do agregado familiar.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>182 silicone kit</td>
			<td>182 silicone elastomer kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#8226;2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#8226;7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>To adjust pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758</td>
			<td>To adjust pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material Name</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting tools</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>assortment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect Pins</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc</td>
			<td>26001-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PZMIII-BS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass electrodes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS7095B5X</td>
			<td>Box of 200, suction electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MD4-M3-R</td>
			<td>Can fix for base or on a metal rod</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire (10/1,000 inch)</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>782500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC/DC differential amplifier</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>Model 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLab 26T</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>27T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head stage</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Comes with AC/DC amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabChart7</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical leads</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tools</td>
			<td>make yourself</td>
			<td></td>
			<td>For manipulating nerves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cable and connectors</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes with bulbs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7</td>
			<td>Box of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax or modeling clay</td>
			<td>any company or local stores</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>Grass Instruments</td>
			<td>SD9 or S88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tip for suction electrode</td>
			<td>local hardware store (Watt&#39;s brand)</td>
			<td>&#188; inch OD x 0.170 inch ID</td>
			<td>Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neural circuit recording from an intact cockroach nervous system

A preparação cordão nervoso ventral barata é um sistema tratável para experimentos Neuroetologia, modelagem de rede neural, e testar os efeitos fisiológicos de inseticidas. Este artigo descreve o âmbito da barata modalidades sensoriais que podem ser utilizados para ensaiar a forma como um sistema nervoso de insectos às perturbações ambientais. A ênfase aqui é sobre o comportamento de fuga mediada por cercos a transmissão de fibra gigante em Periplaneta americana. Esta em preparação situ requer apenas habilidade de dissecação moderada e experiência eletrofisiológica para gerar gravações reprodutíveis de atividade neuronal. Os péptidos ou outros reagentes químicos podem, então, ser aplicada directamente para o sistema nervoso, em solução com a solução salina fisiológica. Insecticidas também pode ser administrado antes de dissecção e o circuito de fuga pode servir como um indicador para o estado excitável do sistema nervoso central. Neste contexto, os ensaios aqui descritos, também seriam úteis para resquisadores interessados ​​na regeneração de membros e da evolução do desenvolvimento do sistema nervoso para que P. americana é um organismo modelo estabelecido.

Estimulação dos cabelos na cerci por um sopro de ar faz com que as descargas de neurônios sensoriais primários que podem ser gravados utilizando eletrodos de sucção extracelulares ligados tanto para conectivos entre gânglios abdominal ou o próprio nervo Cercal (Figura 8). Amplitudes de Spike gravados a partir das duas regiões são da ordem de vários micro-volts para milivolts. Por causa da integração sensorial no gânglio do número de picos observados no potencial de ação composto ou como picos individuais gravados a partir do nervo Cercal é notavelmente maior do que o observado nas gravações dos conectivos. No entanto, note também que há substancialmente menos ruído na gravação no conjuntivo devido ao selo mais apertado entre o eletrodo eo tecido nervoso. Ao soprar o ar para os grandes picos Cerci pode ser observado nas conectivos (Figura 8A). Usando este método estimulante, gravações entre A3 e A4 típico<html> ly mostram um grande pico característico do interneurônio gigante (s). Gravar a partir de um nervo Cercal, enquanto esfregando fisicamente o cerci com uma pinça produziu uma forte busto de atividade (Figura 8B 1). Em outra gravação, duas baforadas de ar cada produziu uma resposta rápida rebentando no nervo Cercal (Figura 8B 2). Ao estimular eletricamente o nervo Cercal com um eletrodo de sucção e de gravação no conjuntivo entre A3 e A4, pode-se observar um limite na estimulação de respostas evocadas (Figura 8C 1). A estimulação elétrica do nervo Cercal provoca claramente uma resposta em conectivos que pode ser quantificada para estudos de manipulação com agentes farmacológicos ou envolve o meio ambiente local, como a temperatura (Figura 8C 2). <html> fig1.jpg &quot;/&gt; Americana Figura 1. Periplaneta com cerci intacta. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig2.jpg" /> Figura 2. Vista ventral do cordão nervoso barata como visto com a cutícula ventral removido (A). Uma vista ampliada do segmento esboçado pelas setas é visto em (B). Em (C) os conectivos foram derramados entre A4 e A3 com uma sonda de vidro. A 6 ª gânglio abdominal é mostrado em (D) com os dois nervos Cercal deixando na extremidade caudal. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig3.jpg" /> Figura 3. Esquemática vista ventral do cordão nervoso barata. ys &quot;&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig4.jpg" /> Figura 4. Os cercos são posicionados para cima do banho de solução salina. No abdômen abertas podem ser inundadas com solução salina (A) com a extremidade caudal da barata ser elevada com um pequeno pedaço em forma de cunha de elastômero de silicone, a fim de manter o cerci fora do banho (B). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig5.jpg" /> Figura 5. O gânglio abdominal 6 º com o nervo Cercal (delineado por setas). <img alt="Figura 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig6.jpg" /> Figura 6. O equipamento configurado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50584/50584fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver lar</a>figura ger. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig7.jpg" /> Figura 7. Estimulante e eletrodo de registro configurado. <img alt="Figura 8" fo:content-width="5.75in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig8.jpg" /> Figura 8. Gravações Neurais dos conectivos e nervo do Cercal com vários procedimentos de estimulação. Gravar com um eletrodo de sucção dos conectivos entre A3 e A4, enquanto soprando ar na Cerci (A). Gravar a partir de neurônios Cercal primárias com um eletrodo de sucção enquanto fisicamente esfregando (B 1) ou o fornecimento de sopros de ar (B 2) resulta em rajadas rápidas de atividade no nervo Cercal. Eletricamente estimulando o nervo Cercal produz respostas em conectivos ( <strong&gt; C 1). Notar o aumento gradual da intensidade da estimulação (as setas indicam a amplitude do artefacto de estimulação) e a intensidade das seguintes respostas evocadas. A estimulação elétrica do nervo Cercal fornece um meio relativamente mais controladas de estimular o nervo Cercal para a consistência na estimulação para quantificar as respostas (c 2).

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Neural Circuit Recording from an Intact Cockroach Nervous System

Este artigo descreve a barata ventral do nervo espinhal dissecção e gravações extracelular do nervo Cercal e conectivos. Respostas evocadas são gerados por estimulação elétrica do nervo Cercal ou estimulação mecânica direta da Cerci.

Neural Circuit gravação de um Sistema Nervoso Barata Intacta

The cockroach ventral nerve cord preparation is a tractable system for neuroethology experiments, neural network modeling, and testing the physiological ...

neural-circuit-recording-from-an-intact-cockroach-nervous-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

32.0K visualizações.  University of Kentucky.  Este artigo descreve a barata ventral do nervo espinhal dissecção e gravações extracelular do nervo Cercal e conectivos. Respostas evocadas são gerados por estimulação elétrica do nervo Cercal ou estimulação mecânica direta da Cerci. 

Vídeo: Neural Circuit Recording from an Intact Cockroach Nervous System

Revealing Neural Circuit Topography in Multi-Color

Neural circuits are organized into functional topographic maps. In order to visualize complex circuit architecture we developed an approach to reliably label the global patterning of multiple topographic projections. The cerebellum is an ideal model to study the orderly arrangement of neural circuits. For example, the compartmental organization of spinocerebellar mossy fibers has proven to be an indispensable system for studying mossy fiber patterning. We recently showed that wheat germ agglutinin (WGA) conjugated to Alexa 555 and 488 can be used for tracing spinocerebellar mossy fiber projections in developing and adult mice (Reeber et al. 2011). We found three major properties that make the WGA-Alexa tracers desirable tools for labeling neural projections. First, Alexa fluorophores are intense and their brightness allows for wholemount imaging directly after tracing. Second, WGA-Alexa tracers label the entire trajectory of developing and adult neural projections. Third, WGA-Alexa tracers are rapidly transported in both retrograde and anterograde directions. Here, we describe in detail how to prepare the tracers and other required tools, how to perform the surgery for spinocerebellar tracing and how best to image traced projections in three dimensions. In summary, we provide a step-by-step tracing protocol that will be useful for deciphering the organization and connectivity of functional maps not only in the cerebellum but also in the cortex, brainstem, and spinal cord.

We provide a practical guide for delivering tracers in vivo and use the spinocerebellar pathway as a model system to demonstrate essential steps for successful neuronal circuit analysis in mice. We describe in detail our versatile tracing protocol that exploits wheat germ agglutinin (WGA) conjugated to Alexa fluorophores.

Revelando Topografia Circuito Neural em Multi-Color

Neural circuits are organized into functional topographic maps. In order to visualize complex circuit architecture we developed an approach to reliably ...

Neurociência

Preparation of an Awake Mouse for Recording Neural Responses and Injecting Tracers

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13. In the auditory system, fundamental response properties of brainstem neurons including threshold, frequency specificity, and inhibitory sidebands are altered in significant ways under anesthesia1-2. These observations prompted physiologists to seek ways to record from single neurons without the contaminating effects of anesthesia. One result was a decerebrate preparation, where the brainstem was completely transected at the level of the midbrain4. The drawbacks of this preparation are a formidable surgery, the elimination of descending projections from the forebrain, and an inability to use sensory stimulation to examine structures above the midbrain. A different strategy has been to implant electrode arrays chronically to record from single neurons and multiunit clusters while the animal is awake and/or behaving5,6. These techniques however are not compatible with injecting tracer dyes after first electrophysiologically characterizing a brain structure. To avoid altering neural response properties with anesthetics while recording electrophysiological response properties from single neurons, we have adapted a head restraint technique long used in bats7-9 to mouse10-12. Using this method, we are able to conduct electrophysiological recordings over several days in the unanesthetized mouse. At the end of the recording sessions, we can then inject a dye to reconstruct electrode positions and recording sites or inject a tracer so that pathways to and from the recording loci can be determined. This method allows for well isolated single neuron recordings over multiple days without the use anesthetics.

Electrophysiological characterization of neuronal responses is important for understanding brain function and for guiding the placement of dyes for pathway tracing. However, many studies are performed in anesthetized animals. To understand brain function without anesthetics, we developed a method to record neuronal response properties and inject dyes in awake mouse.

Preparação de um mouse Awake para gravar as respostas neurais e injetando Tracers

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13.  In the auditory system, fundamental response ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

Produção de lentivirais para Células Transdução do Sistema Nervoso Central

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

Um Paradigma para Investigar Lesão de reparação do sistema nervoso central em<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

Registro da atividade elétrica dos neurônios identificados no cérebro intacto de peixes transgénicos

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory environment and the limited capacity for neurogenesis. We are developing&#160;a strategy to simultaneously address&#160;neuronal and axonal pathway loss within the damaged CNS. This manuscript presents the fabrication protocol for micro-tissue engineered neural networks (micro-TENNs), implantable constructs consisting of neurons and aligned axonal tracts spanning the extracellular matrix (ECM) lumen of a preformed hydrogel cylinder hundreds of microns in diameter that may extend centimeters in length. Neuronal aggregates are delimited to the extremes of the three-dimensional encasement and are spanned by axonal projections. Micro-TENNs are uniquely poised as a strategy for CNS reconstruction, emulating aspects of brain connectome cytoarchitecture and potentially providing means for network replacement. The neuronal aggregates may synapse with host tissue to form new functional relays to restore and/or modulate missing or damaged circuitry. These constructs may also act as pro-regenerative&#160;&#34;living scaffolds&#34; capable of exploiting developmental mechanisms for cell migration and axonal pathfinding, providing synergistic structural and soluble cues based on the state of regeneration. Micro-TENNs are fabricated by pouring liquid hydrogel into a cylindrical mold containing a longitudinally centered needle. Once the hydrogel has gelled, the needle is removed, leaving a hollow micro-column. An ECM solution is added to the lumen to provide an environment suitable for neuronal adhesion and axonal outgrowth. Dissociated neurons are mechanically aggregated for precise seeding within one or both ends of the micro-column. This methodology reliably produces self-contained miniature constructs with long-projecting axonal tracts that may recapitulate features of brain neuroanatomy. Synaptic immunolabeling and genetically encoded calcium indicators suggest that micro-TENNs possess extensive synaptic distribution and intrinsic electrical activity. Consequently, micro-TENNs represent a promising strategy for targeted neurosurgical reconstruction of brain pathways and may also be applied as biofidelic models to study neurobiological phenomena in vitro.

This manuscript details the fabrication of micro-tissue engineered neural networks: three-dimensional micron-sized constructs comprised of long aligned axonal tracts spanning aggregated neuronal population(s) encased in a tubular hydrogel. These living scaffolds can serve as functional relays to reconstruct or modulate neural circuitry or as biofidelic test-beds mimicking gray-white matter neuroanatomy.

Redes neuronais modificadas por micro-tecidos tridimensionais com inspiração anatômica para a reconstrução, modulação e modelagem do sistema nervoso

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

Eletrofisiológica gravação da atividade do sistema nervoso Central de terceiro ínstar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural circuits. Due to the fractional change in the light signal, it has been difficult to use this method as a quantitative assay. This article describes special optics and slice handling systems, which render this technique stable and reliable. The present article demonstrates the slice handling, staining, and recording of the VSD-stained hippocampal slices in detail. The system maintains physiological conditions for a long time, with good staining, and prevents mechanical movements of the slice during the recordings. Moreover, it enables staining of slices with a small amount of the dye. The optics achieve high numerical aperture at low magnification, which allows recording of the VSD signal at the maximum frame rate of 10 kHz, with 100 pixel x 100-pixel spatial resolution. Due to the high frame rate and spatial resolution, this technique allows application of the post-recording filters that provide sufficient signal-to-noise ratio to assess the changes in neural circuits.

We introduce a reproducible and stable optical recording method for brain slices using voltage-sensitive dye. The article describes voltage-sensitive dye staining and recording of optical signals using conventional hippocampal slice preparations.

Gravação ótica do único-fóton do largo-campo em fatias do cérebro usando a tintura tensão-sensível

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

Dissecção e isolamento da glia murina de múltiplas regiões do sistema nervoso central

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Evaluation and Manipulation of Neural Activity Using Two-Photon Holographic Microscopy

Recent advances in optical bioimaging and optogenetics have enabled the visualization and manipulation of biological phenomena, including cellular activities, in living animals. In the field of neuroscience, detailed neural activity related to brain functions, such as learning and memory, has now been revealed, and it has become feasible to artificially manipulate this activity to express brain functions. However, the conventional evaluation of neural activity by two-photon Ca2+ imaging has the problem of low temporal resolution. In addition, manipulation of neural activity by conventional optogenetics through the optic fiber can only simultaneously regulate the activity of neurons with the same genetic background, making it difficult to control the activity of individual neurons. To solve this issue, we recently developed a microscope with a high spatiotemporal resolution for biological applications by combining optogenetics with digital holographic technology that can modify femtosecond infrared laser beams. Here, we describe protocols for the visualization, evaluation, and manipulation of neural activity, including the preparation of samples and operation of a two-photon holographic microscope (Figure 1). These protocols provide accurate spatiotemporal information on neural activity, which may be useful for elucidating the pathogenesis of neuropsychiatric disorders that lead to abnormalities in neural activity.

We developed a two-photon holographic microscope that can visualize, assess, and manipulate neural activity using high spatiotemporal resolution, with the aim of elucidating the pathogenesis of neuropsychiatric disorders that are associated with abnormal neural activity.