O objetivo geral deste vídeo atual é explicar o protocolo de uma dupla injeção direta de sangue na cisterna magna como modelo de hemorragia subaracnóide. A fisiologia da hemorragia subaracnóide é frequentemente devido a uma ruptura de um aneurisma. E primeiro fazemos a extravasação de sangue no compartimento entre o cérebro e o tecido que cobre o cérebro.
Este compartimento é o espaço subaracnóide. A hemorragia subaracnóide é responsável por até 7% de todos os casos de greve. A mortalidade varia entre 30 a 50% em estudos de base populacional e sobreviventes de hemorragia subaracnóides geralmente experimentam sequelas cognitivas como déficits de memória, asthenia ou distúrbios de humor.
A principal causa na alta prevalência de desfecho ruim é o que é isquemia cerebral. Estudos fizeram uma ligação entre a ocorrência de isquemia na vasoconstrição das grandes artérias cerebrais, denominadas vasospasmo microscópico que pode ser detectado na maioria dos pacientes entre o quarto e o décimo quinto dia após o primeiro evento de inchaço. Devido à ineficiência das opções terapêuticas atuais, há uma necessidade médica óbvia para uma melhor compreensão dos eventos patológicos.
A hemorragia subaracnóide e novos alvos terapêuticos devem ser testados, mas isso requer modelos animais variados e padronizados. A ruptura do aneurisma intercraniano, principalmente responsável pela hemorragia subaracnóide em humanos, é provavelmente difícil de fazer modelos pré-clínicos e humanos. Em animais, as principais dificuldades residem na incidência de controle de hemorragia e distribuição sanguínea, mas estudos recentes focam no desenvolvimento de modelos mais averídicos de modelos de hemorragia subaracnóide.
Aqui representam um modelo de rato padronizado de duas injeções consecutivas de sangue arterial autólogo de nossos dois dias na cisterna magna. As principais vantagens deste modelo são dominar reproduzivelmente um procedimento cirúrgico não invasivo, adaptar a qualidade e quantidade do sangue injetado, e reforçar o evento sanguíneo sem aumentar drasticamente a pressão intracraniana. Antes do início da cirurgia, você tem que colocar outro grande número de capilares de vidro usando um puxador de micropipette.
A pipeta injetora deve apresentar um diâmetro interno de 0,86 milímetros e um diâmetro externo de 0,5 milímetros. Prepare o fluido espinhal cerebral artificial para a condição falsa, conforme indicado no protocolo escrito. Você deve perceber este fluido cerebral cerebral oxigenado com um aparelho de filtro de 0,22 mícrons.
O primeiro passo do nosso modelo de hemorragia subaracnóide consiste no isolamento da artéria carótida ao longo da traqueia e na coleta do máximo de sangue da punção arterial carótida. Após a anestesia por isoflurane, verifique a falta de reflexos apertando um ou dois membros traseiros para permitir a configuração do procedimento experimental. Código uma seringa de um milímetro com Eprin usando uma agulha calibre 26.
Isso evitará a coagulação sanguínea durante os próximos passos. Pesar cada mouse precisamente usando um equilíbrio eletrônico. No presente estudo, os camundongos teriam peso corporal na faixa de 20 a 25 gramas pouco antes da cirurgia.
Como explicado anteriormente, induziu anestesia do mouse operado e, em seguida, raspar o pescoço e o espaço entre cada orelha por meio de um cortador elétrico adequado. Verifique se o mouse está dormindo e a cabeça do rato está bem bloqueada. Injete subcutâneamente 100 microliters de buprenorfina a 0,1 miligramas por quilo com uma agulha de calibre 26 na parte inferior das costas para evitar dor após o despertar.
Evite olhos secos usando um gel líquido protetor e mantenha a temperatura intradutora de 37 graus usando uma manta elétrica autorregulada. Antes de tratar a área raspada com uma solução antisséptica, todos os instrumentos que tocavam o tecido foram esterilizados e foram manuseados asepticamente. No primeiro dia, corte uma incisão de um centímetro de comprimento no pescoço posterior, seguida pela separação dos músculos ao longo da linha média, para acessar a cisterna magna.
Corte a ponta da pipeta de vidro vazia com uma tesoura fina. Em seguida, adapte-se a uma seringa conectada a um conector de silício flexível. Em seguida, transfira 60 microliters de sangue ou fluido espinhal cerebral artificial em um tubo de 0,5 mililitro usando uma micropipette de precisão Suga para a pipeta de vidro, os 60 microliters de sangue para a condição de hemorragia subaracnóide ou 60 microliters de fluido cerebral cerebral para a condição falsa.
Para injeção, insira a pipeta no quadro estereotático usando, por exemplo, nosso anel ou a e aproxime lentamente a ponta da pipeta na membrana da interface com a cisterna magna. Insira lentamente a ponta da pipeta através da membrana atlanto-occipital na cisterna magna usando um micromanipulador do quadro estereotático. Conecte a pipeta à seringa previamente preenchida, pronta para indução de pressão.
Injetar pela pressão a uma taxa baixa em torno de 10 microliters por minuto para evitar hipertensão intracraniana aguda. Durante a injeção, monitore de perto a taxa respiratória e a temperatura retal. No final da injeção, retire cuidadosamente a pipeta usando o micromanipulador e tome cuidado visualmente não há vazamento durante a retirada.
Alcance a homeostase e realize duas suturas com fio de sutura trançado não absorvível. Imediatamente após a cirurgia, isole e posicione o rato em decúbito de declínio e cubra com um cobertor de sobrevivência em uma caixa aberta durante a duração da recuperação. Após 24 horas, induza novamente a anestesia, instale o mouse no quadro estereotático como no dia anterior e remova com cuidado as suturas com micro-tesoura.
Prepare-se como antes asséptico da membrana atlanto-occipital, aplicando-se na área raspada e solução asséptica com uma vara de algodão. Injete, como no dia anterior, 30 microliters de sangue ou fluido cerebral artificial em uma taxa baixa. Como já mencionado, monitore a taxa respiratória e a temperatura retal.
No final da injeção, retire cuidadosamente a pipeta e controle a ausência de vazamento de sangue durante a retirada. Alcance a homeostase e realize duas suturas com um fio de sutura absorvível trançado. Desde o primeiro dia de pós-cirurgia até o dia do sacrifício, o peso corporal deve ser avaliado diariamente como um indicador sensível para o bem-estar geral.
Mostrou um ganho significativo de peso corporal reduzido na hemorragia subaracnóide, em comparação com animais falsos, sugerindo um processo de recuperação de atividades duradoura e eventos patológicos prolongados, hemorragia pós-subaracnóide. Por que a mortalidade não está em falsas condições? A mortalidade é de quase 30% no sétimo dia em condição de hemorragia subaracnóide, com a maioria dos animais morrendo no um ou quarto dia após a cirurgia.
Entre os pontos finais humanos, nota-se perda de peso significativa superior a 15% do peso inicial. Uma postura curvada, movimentos lentos, feridas, vocalizações anormais ou agressividade significativa também são sinais de que o animal está sofrendo. Se algum desses sinais ou uma combinação de sinais aparecer, o rastreamento do animal é reforçado em poucas horas que se seguem à sua aparência.
Se a condição do animal piorar na hora que se segue ou não melhorar dentro de 48 horas, será considerado que um nível de sofrimento intolerável é atingido e a matança é realizada. Neste exemplo no primeiro dia de cirurgia, pode ser observado a partir de um cérebro amostral, coágulos sanguíneos ao longo das grandes artérias do polígono willis no sujeito hemorragia subaracnóide. No quinto dia após a cirurgia e antes do sacrifício, a injeção intervascular de tinta indiana permite a detecção de vasospasmo macroscópico correspondente à vasoconstrição de grandes artérias cerebelares, a coloração de fatias cerebrais com hematoxilina e eosina permite a medição do vasospasmo cerebral.
Aqui, como ilustrado nesta micrografia fotográfica, você pode observar como um vasospasmo da artéria basilar. Neste modelo de desvio da injeção direta de sangue para a cisterna magna, recentemente demonstramos vasospasmo cerebral de grandes artérias cerebrais, deposição de fibril vascular cerebral e apoptose celular, acompanhado de funções sensoriais, motoras e cognitivas alteradas em camundongos. Assim, torna esse modelo validado e caracterizado para eventos de curto e longo prazo, pós hemorragia subaracnóide.
Deve ser idealmente adequado para a identificação prospectiva de novas metas e para estudos sobre estratégias terapêuticas eficientes contra complicações associadas à hemorragia subaracnóide.
