Este protocolo é importante, pois permite a investigação do sistema glifático em um grande mamífero, aproximando-nos da compreensão do sistema glicêntico em humanos. Há duas vantagens nessa técnica. A introdução de traços na cisterna magna evita qualquer dano direto ao cérebro, o que contrasta com as injeções intraventriculares.
Em segundo lugar, trata-se de uma abordagem direta que permite a visualização imediata da cannulação e saber se ela foi ou não bem sucedida. Comece colocando o porco em uma posição propensa. Palpa a parte de trás de sua cabeça e pescoço para localizar e marcar a crista occipital, a coluna das primeiras vértebras torácicas, e a base de cada orelha.
Desenhe uma linha reta entre a crista e as vértebras ao longo do eixo longitudinal. Em seguida, seguindo a base do crânio, desenhe duas linhas da crista até a base de cada orelha. Fixar cuidadosamente a cauda do animal e observar um reflexo para ver se ele está em um sono profundo.
Comece fazendo uma incisão dérmica ao longo da linha longitudinal até o músculo usando um bisturi com uma lâmina número 21, em seguida, estender duas incisões perpendiculares mais ao longo dos ombros, cada uma de 10 a 15 centímetros de comprimento. Partindo da crista occipital, faça incisões dérmicas ao longo da linha até a base de cada orelha. Use fórceps anatômicos para segurar os cantos da pele formados na crista occipital, em seguida, executar a lâmina do bisturi levemente sobre a fáscia para separar a pele do músculo subjacente.
Ressele a pele ao longo de cada uma das cinco incisões para visualizar partes do músculo trapézio. Use o bisturi para fazer uma incisão longitudinal de aproximadamente um centímetro de profundidade onde o trapézio se reúne na linha média, em seguida, realizar uma dissecção contundente ao longo do corte longitudinal nos músculos usando uma combinação de fórceps cirúrgicos retos e curvados, que separarão as barrigas do trapézio e do músculo semi-revolucionário subjacente capitis biventer. Corte qualquer fibra muscular persistente com um bisturi e continue a realizar dissecção contundente até que o complexo se tornar visível.
Mova-se ao longo do aspecto posterior do crânio e corte as origens dos músculos trapézio e semi-pinalis capitis biventer. Para separar os dois músculos longitudinalmente, use os fórceps cirúrgicos para realizar dissecção contundente até que o complexo semiespinhal capitis seja totalmente visível. Em seguida, use os retráteis auto-retentores para retrair os músculos trapézio e semi-pinalis capitis biventer.
Use o bisturi para fazer uma incisão longitudinal de um centímetro de profundidade onde as barrigas do complexo semispinalis capitis se unem na linha média. Realize uma dissecção contundente usando fórceps cirúrgicos trabalhando ao longo do corte longitudinal entre as barrigas musculares até que tanto o atlas quanto o eixo sejam palpáveis. Mova-se ao longo do aspecto posterior do crânio, cortando as origens dos músculos semispinalis capitis complexus.
Use o bisturi e a dissecção contundente para separar o músculo longitudinalmente das vértebras subjacentes, em seguida, use outro conjunto de retráculos auto-retentores para retrair os músculos semispinalis capitis complexus. Use um bisturi para remover cuidadosamente qualquer tecido remanescente sobrepondo a região onde o atlas encontra a base do crânio. Coloque um braço no pescoço do animal e um dedo na conjuntura do atlas e no crânio, em seguida, eleve simultaneamente a cabeça e flexione o pescoço enquanto palpating com o dedo para revelar a cisterna magna.
Certifique-se de que uma pessoa eleva e flexiona a cabeça e o pescoço do animal enquanto a outra palpatiza para a cisterna magna, anotando sua localização anatômica. Introduza uma cânula de 22 bitola lentamente e cuidadosamente na cisterna magna através da dura dura em um ângulo oblíquo ao eixo longitudinal, em seguida, retraia a agulha da cânula e coloca uma tampa na fechadura. Comece com a aplicação de super cola e um acelerador onde a cânula entra no tecido, em seguida, aplique o cimento dentário.
Espere cinco minutos para o cimento endurecer. Retire a tampa cuidadosamente da cânula. Conecte a cânula à extremidade masculina da linha IV com o rastreador usando uma extensão de 10 centímetros.
Injete o rastreador lentamente a uma taxa de 100 microliters por minuto, à mão ou usando uma bomba de micro infusão. Remova a torneira da linha IV e substitua-a pela tampa. Verifique se o rastreador está visível pulsando na base da cânula.
Em seguida, coloque sacos de areia sob o pescoço do animal para manter alguma flexão. Solte a cabeça e deixe o animal em uma posição propensa a repouso. Solte os retráteis de auto-retenção e substitua os músculos.
Use os grampos cirúrgicos da toalha para unir a pele sobre os músculos. Primeiro use gaze e depois um cobertor para cobrir os grampos de toalha e a incisão para limitar a perda de calor. Permita que o rastreador circule pelo tempo desejado.
Imagens macroscópicas costuradas da superfície dorsal do cérebro podem fornecer insights detalhados sobre os padrões de distribuição do rastreador através do sulci e fissuras. Imagens semelhantes das superfícies ventral e lateral do cérebro podem fornecer informações sobre a distribuição do rastreador no lobo temporal e na fissura lateral. Imagens da superfície cerebral de maior ampliação produzida usando um estereoscópio podem ajudar a visualizar o rastreador no PVS ao longo das artérias.
As seções cerebrais coronal macroscópicas fornecem uma visão da profundidade da penetração do rastreador na distribuição e estrutura de traços interêmesféricos e interconóféricos, como o hipocampo e o estriado. A coloração imunohistoquímica para AQP4, proteína ácida fibrilar gliana e actina muscular lisa mostrou que o rastreador localizado dentro do PVS, bem como se mudou para o parenchyma cerebral. Os processos de pé astrócito que formam a superfície externa do PVS são identificados utilizando a coloração de proteína ácida AQP4 e fibrilar gliais.
As células endoteliais que formam a superfície interna do PVS são manchadas usando lectina e mancha GLUT-1. A coloração de SMA identifica artérias e artérias e pode ser usada para mostrar que o fluxo de PVS ocorre ao longo das artérias em vez de veias, o que constitui a fisiologia básica da função glifática normal. Daqui para frente, esperamos explorar o sistema glifático em alta resolução em grandes mamíferos no contexto da neuropatologia, como derrame e lesão cerebral traumática.
