Caracterizar as propriedades de transporte da terapêutica e de seus portadores é fundamental para garantir respostas biológicas eficazes. Esses métodos auxiliam na concepção de portadores de medicamentos com a carga ideal para direcionar tecidos carregados negativamente. A principal vantagem dessas técnicas é sua capacidade de prever melhor as eficácias terapêuticas in vivo através de uma série de experimentos in vitro que caracterizam o transporte de soluto através do tecido.
As doenças da cartilagem, como a osteoartrite, permanecem não tratadas devido à incapacidade de as drogas penetrarem na densa matriz de cartilagem avascular, exigindo que os portadores de drogas prólogos sejam eficazes terapêuticas. Comece usando uma limpeza de tarefa delicada para remover suavemente o excesso de PBS das superfícies de três milímetros de diâmetro, umaima de espessura explantes de cartilagem. Use um equilíbrio para registrar rapidamente o peso úmido de cada explanta e coloque imediatamente as explantas em um banho pbs para evitar a desidratação.
Em seguida, adicione 300 microliters de recém-preparado, 30 micromolar fluorescente rotulado solução portadora de peptídeo cationic por poços bem para os poços internos de uma placa de 96 poços e use uma espátula para adicionar uma explanta a cada poço de solução. Encha cada um dos poços circundantes com 300 microliters de PBS e cubra a placa com uma tampa. Sele as bordas da placa com filme flexível para minimizar a evaporação e coloque a placa em um agitador em uma incubadora de 37 graus Celsius por 24 horas a 50 revoluções por minuto, com uma órbita de 15 milímetros.
Ao final da incubação, transfira o banho de equilíbrio de cada poço para tubos individuais de polipropileno e faça diluições seriais a partir do estoque 30 soluções portadoras de peptídeos cationic micromolar para gerar uma curva padrão. Em seguida, transfira 200 microliters de cada solução e padrão em poços individuais de uma placa preta de 96 poços e obtenha leituras de fluorescência de cada amostra e padrão com base nos comprimentos de onda de excitação e emissão do rótulo fluorescente. Para determinar a profundidade da penetração do portador de peptídeo cationic dentro de uma explanta de cartilagem, use um bisturi para cortar o diâmetro de seis milímetros, uma cartilagem milimétrica de espessura explanta ao meio e hidratar as peças de meio disco resultantes com inibidor de proteus complementado PBS.
Aplique epóxi no centro de um poço de uma câmara de transporte unidimensional projetada sob medida e proteja uma explanta de meio disco dentro do poço com o lado superficial da explant voltada para o lado upstream da câmara. Remova qualquer excesso de cola do poço para evitar o contato com a superfície de difusão da cartilagem e adicione 80 microliters de inibidor de protease complementado PBS a ambos os lados da explanta. Pipetar o líquido para cima e para baixo em um lado da explanta para verificar se há vazamento para o outro lado.
Se não houver vazamento, substitua o inibidor de protease complementado PBS do lado upstream por 80 microliters de 30 micromolars rotulados solução portadora de peptídeo cônico e coloque cuidadosamente a câmara de transporte em um prato de cultura celular. Cubra a base do prato com PBS para evitar a evaporação da solução de peptídeo cationic. Tomando cuidado para que não haja contato direto entre as soluções das câmaras upstream e downstream.
Coloque o prato coberto em um agitador para limitar a sedimentação de partículas por quatro ou 24 horas à temperatura ambiente e 50 revoluções por minuto, com uma órbita de 15 milímetros. No final da incubação, remova as explantas da câmara e corte aproximadamente 100 mícrons de espessura do centro de cada explanta. Coloque cada fatia de explante entre um escorregador de vidro e um deslizamento de cobertura e hidrate as fatias com inibidor de protease fresco complementado PBS.
Fixar o slide no estágio de um microscópio confocal e obter uma pilha de imagens fluorescentes Z através da espessura total da fatia na ampliação de 10X. Abra o arquivo de imagem e a imagem J, clique em Imagem e selecione Stacks e Z Project no menu suspenso. Em seguida, insira os números de fatias de uma para a fatia final e em Tipo de Projeção, selecione a intensidade média e clique em Ok.
Para avaliar a taxa de difusão da cartilagem do portador de peptídeo cationic não-equilíbrio, monte cada metade da câmara de transporte, para incluir uma junta de borracha grande, uma inserção de polimetilmetato e uma pequena junta de borracha. Meça a espessura de uma explanta de cartilagem e coloque a explanta nos poços da inserção plástica com a superfície superficial voltada para a câmara upstream e sanduiche as duas metades juntas para completar a montagem. Use uma chave inglesa para aparafusar firmemente as metades antes de encher a câmara a montante com dois mililitros de inibidor de protease complementado PBS.
Verifique a câmara a jusante para vazamento da câmara rio acima. Se não for detectado vazamento, encha a câmara a jusante com dois mililitros de inibidor de protease complementado PBS. Adicione uma única mini barra de mexiça nas câmaras para cima e para baixo e coloque a câmara em uma placa de agitação com a câmara alinhada de tal forma que o laser do espectrofotômetro esteja focado no centro da câmara a jusante.
Com a porção do receptor de sinal do espectrofotômetro atrás da câmara a jusante, colete leituras estáveis e em tempo real de emissão de fluorescência a jusante por pelo menos cinco minutos. Após obter uma leitura estável, adicione um volume pré-calculado de solução de estoque de peptídeos cationic rotulados fluorescentemente à câmara upstream para uma concentração final de banho de três micromolares, e monitore o sinal fluorescente a jusante, permitindo que o transporte soluto atinja um aumento constante na inclinação. Uma vez alcançado um estado estável, transfira 20 microliters de solução da câmara upstream para a câmara a jusante para um teste de espigão e colete as leituras de fluorescência a jusante em tempo real.
Uma carga positiva muito alta limitará a penetração de soluto à zona superficial à medida que o portador se liga muito fortemente aos grupos aggrecanos carregados negativamente da matriz de cartilagem. Por outro lado, os portadores que são capazes de tirar proveito de interações de carga fracas e reversíveis penetram através da zona profunda do tecido. Um portador de medicamentos com a carga ideal, no entanto, não só penetraria nas zonas profundas do tecido, mas também demonstraria uma alta absorção intra-tecidual, que pode ser determinada usando as medidas de fluorescência do banho de equilíbrio e do peso molhado do tecido, como mostrado.
Experimentos de transporte de difusão de não equilíbrio resultam em uma curva gerada por dados com uma inclinação gradualmente crescente. A parte inicial da curva representa a difusão soluto através da cartilagem à medida que ocorrem interações de ligação matriz soluto. Uma vez que os solutos atingem a câmara a jusante, a inclinação da curva aumenta à medida que as leituras de fluorescência aumentam com o tempo.
Esta segunda parte da curva então atinge uma inclinação constante, representando difusão de estado estável. A interceptação X de uma linha tangencial desenhada na porção de estado estável da curva indica o tempo necessário para alcançar a difusão de estado estável ou tau lag. Após a transferência da solução do rio para a câmara a jusante, observa-se um pico de fluorescência, momento em que a intensidade estabilizada da fluorescência pode ser usada para correlacionar a fluorescência à concentração.
O representante efetivo de difusividade e valores de difusão estatal constante pode então ser calculado, conforme indicado. Observe que a difusividade estatal constante é duas ordens de magnitude superior à difusividade efetiva como resultado de todos os locais de vinculação baseados em cargas sendo ocupados. Assim, neste ponto, a difusão é baseada no tamanho e não na carga, resultando em valores de difusão de estado estável semelhantes entre os CPCs do mesmo tamanho.
Manter a hidratação explant e minimizar a evaporação da solução durante todo o experimento para evitar alterações na morfologia da cartilagem e na concentração da solução, respectivamente, e para garantir a aquisição precisa e reprodutível de dados. Seguindo o projeto de um portador de drogas com a carga ideal, várias técnicas de conjugação podem ser utilizadas para modificar medicamentos para melhor direcionamento tecidual e facilitar a avaliação de sua eficácia biológica.
