DetectSyn aproveita a tecnologia de ensaio de ligadura de proximidade para identificar rapidamente mudanças nas sinapses. Também fornecemos um protocolo para analisar os resultados. A principal vantagem do DetectSyn é a rapidez com que os resultados podem ser obtidos nas grandes regiões de tecido que podem ser analisadas.
Para começar, remova cuidadosamente a solução de bloqueio com uma pipeta pasteur de plástico sem perturbar as células. Em seguida, forrar uma grande placa de petri de plástico com Parafilm. E usando fórceps, transfira cuidadosamente os deslizamentos de cobertura para o Parafilm.
Adicione 60 microliters da solução de anticorpos primários à parte superior da tampa, garantindo que a solução de anticorpos não derrame sobre as laterais do deslizamento da tampa. Para fornecer umidade e evitar que as amostras sequem durante a incubação, adicione água ultrauso a uma placa de Petri menor e coloque cuidadosamente a placa ao redor dos deslizamentos de cobertura. Em seguida, cubra a placa de Petri maior e incuba as células cultivadas por uma hora à temperatura ambiente.
Após a incubação com o anticorpo primário, use fórceps para cortar cuidadosamente a solução de anticorpos primários da tampa desliza para uma toalha de papel e transfira os deslizamentos de cobertura para sua placa original de 24 poços cheia com 500 microliters de PBS. Em seguida, lave as amostras com PBS três vezes por 10 minutos cada uma com agitação suave em um agitador orbital. Após a última lavagem, transfira a tampa desliza de volta para a grande placa de Petri e adicione 40 microliters da solução de anticorpos secundários ao topo da tampa.
Cubra a placa de Petri e incuba as amostras a 37 graus Celsius por uma hora. Para a ligadura, mantendo o ligase em um bloco frio, diluir o ligase de 1 a 40 usando o estoque de ligadura e adicionar imediatamente 40 microliters da mistura de ligase aos deslizamentos de cobertura. Cubra a placa de Petri e incuba as amostras a 37 graus Celsius por 30 minutos.
Para amplificação, diluir a polimerase 1280 em um bloco frio usando o estoque de amplificação. Em seguida, adicione 40 microliters da mistura de amplificação aos deslizamentos de cobertura e incubar as amostras por 100 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, para a montagem, solte três microliters de mídia de montagem em um slide.
Toque no excesso de tampão de lavagem do deslizamento da tampa e coloque o deslizamento da tampa com as células voltadas para baixo na mídia de montagem. Sele os lados com uma pequena quantidade de esmalte transparente para manter o deslizamento da tampa no lugar. Para a montagem do tecido fatiado, transfira cuidadosamente uma fatia de tecido para o slide preparado e coloque-a plana.
Em seguida, deixe cair de 5 a 10 microliters de mídia de montagem na fatia de tecido. Coloque uma tampa de vidro sobre a fatia de tecido e sele o deslizamento da tampa com esmalte claro, como demonstrado anteriormente. Para imagens digitais com um microscópio confocal, ajuste o ganho, deslocamento e poder laser para cada canal fluorescente para diminuir o ruído de fundo e melhorar o sinal fluorescente.
Certifique-se de que o sinal fluorescente não está supersaturado. Para os neurônios da cultura, na guia ND Acquisition, clique em Salvar para Arquivo. Em seguida, em Procurar, escolha um arquivo para salvar a imagem e insira o nome do arquivo.
Em seguida, na guia Z, selecione a opção Modo Simétrico Definido por Intervalo. Defina o foco para o melhor mapa de dois planos e clique no botão Relativo para definir este plano focal como o meio da pilha z. Em seguida, defina o intervalo para cinco micrômetros com um passo de micrômetro e verifique Fechar o obturador ativo durante o movimento Z.
Na guia Comprimento de onda, selecione o nome do botão óptico com as configurações de aquisição configuradas anteriormente em Configuração Óptica e clique em Executar agora. Para tecido fatiado, a partir do menu de aquisição escolha Digitalizar grande imagem e, em seguida, sob o painel de captura, selecione o botão óptico com as configurações de aquisição previamente configuradas. Além disso, selecione o objetivo correto neste painel.
Em seguida, sob o painel de área e a peça ocular, use as teclas de seta para definir os limites da região de interesse ou ROI. Em seguida, clique em Salvar imagem grande para arquivar e criar um nome de arquivo save path para a imagem. Finalmente, no painel de configuração, certifique-se de que o Multichannel Capture seja verificado.
Em seguida, escolha o nome do botão óptico com as configurações de aquisição previamente configuradas em configuração óptica. No ImageJ, abra a opção limiar indo para o menu de imagem, clicando em Ajustar e, em seguida, Limiar. Escolha a opção Fundo Escuro se a imagem tiver um fundo escuro.
Em seguida, ajuste os limites superiores e inferiores do limiar por configurações de limiar otimizados previamente determinadas e clique em Aplicar. Para células cultivadas, use o canal MAP2 e uma ferramenta de ROI manual livre para desenhar um ROI para cada neurônio, incluindo dendritos e soma. Para o tecido fatiado, desenhe um ROI de mão livre dentro da imagem de fatia que encapsula a área de interesse.
Em seguida, obtenha a área do ROI abrindo o menu Analisar e clicando em Medir. Para detectar o número de punta dentro de cada ROI, use uma ferramenta de detecção automática como análise de partículas. No menu Analisado, selecione Partículas Analisadas e defina o diâmetro do tamanho do puncta.
Em seguida, a partir do menu suspenso do show, escolha a opção Máscaras sobrepostas, em seguida, verifique a opção Resultados de exibição e clique em Ok. Para dividir o número de punta pela área do ROI individual, copie e cole os resultados de cada imagem a partir dos resultados aparecem em uma planilha. Identifique de qual arquivo e amostra os dados de onde somos obtidos, e divida a área do ROI pelo número de punta.
Por fim, para normalizar os resultados para controle das amostras, média dos resultados das amostras de controle e dividir os resultados obtidos de todas as amostras pela média do controle. O agonista GABAB, baclofen, é necessário para a eficácia in vitro do antidepressivo rápido Ro-256981. Um aumento na formação de sinapse é demonstrado por um aumento no punta branco.
Sem baclofen, não se vê aumento na formação de sinapse. In vivo, a injeção intraperitoneal do antidepressivo rápido resulta em um aumento na formação de sinapse em comparação com o controle salino. Embora alguns punta apareçam nas imagens de controle técnico, eles geralmente não são do mesmo tamanho demonstrado pela especificação branca em comparação com o punta grande nos outros painéis.
Além disso, esses punta não estão no mesmo local que demonstrado por algum punta que aparece dentro da soma. DetectSyn pode identificar alterações nas sinapses devido a um estado da doença ou tratamento medicamentoso. Este método pode ajudar a fornecer insights para qualquer área de pesquisa que estuda os transtornos que afetam o desenvolvimento ou a quebra de sinapses.
