Entender o modo de ação de novos compostos antibacterianos é uma tarefa importante, mas difícil. Este método fornece insights sobre tais mecanismos e é fácil de implementar. Esta técnica permite uma observação em tempo real dos efeitos antibacterianos de forma não invasiva, permitindo uma análise mais aprofundada da amostra.
Embora praticar com técnicas microbiológicas seja um pré-requisito, o experimento é fácil de realizar. Tomar seu tempo com a análise de dados é muito importante na realização de microcalorimetria pela primeira vez. Comece usando um espectrofotômetro em um comprimento de onda de 600 nanômetros para medir a densidade óptica da cultura da noite para o dia.
Diluir a cultura para uma 5 vezes 10 a 5ª colônia formando unidades por mililitro de concentração média mhb fresca e adicionar 150 microliters de células a cada tubo de 1,5 mililitro de antibiótico na concentração de interesse. Em seguida, misture o composto com as células por vórtice. Para preparar as pastilhas, adicione 120 microliters de cada mistura de antibióticos de bactérias em pastilhas plásticas individuais nos poços apropriados de uma placa de 48 poços e use pinças para colocar todos os frascos de titânio nos suportes.
Transfira suavemente as pastilhas nos frascos de titânio na placa do suporte e coloque livremente as tampas de titânio em todos os frascos. Quando todas as pastilhas tiverem sido transferidas, coloque o suporte na área designada na estação de amostra e use uma chave de torque fixada em 40 metros centinewton para apertar todas as tampas. No software do sistema, inicie um novo experimento e retraia o braço de inserção da amostra do instrumento.
Coloque o porta-copos na ponte com a coluna oito voltada para a abertura da inserção da amostra e empurre suavemente o porta-copos para dentro do instrumento na posição um. Aguarde 10 minutos para que o sistema se estabilize antes de rotular os poços experimentais. Em seguida, empurre o braço de inserção da amostra até que o porta-copos esteja na posição dois.
Depois de permitir que o sistema se estabilize por 20 minutos, empurre o braço de inserção da amostra para posicionar três e retraia o braço de inserção da amostra até que ele esteja na posição de execução. Destaque todos os poços do software e selecione o início da reação, em seguida, execute o experimento até que as leituras de emissão de calor sejam imediatamente de volta a zero. No final da análise, selecione parar.
O software perguntará então se você tem certeza. Selecione sim e salve o experimento para análise de dados. Em seguida, insira o braço de inserção da amostra completamente no instrumento e engaje os ímãs para recuperar o suporte do copo.
Para analisar os dados, abra o software e selecione o experimento aberto. Na janela pop-up, selecione o experimento de interesse e clique em abrir. Clique em selecionar todos e definir a linha de base para normalizar os dados em cada posição.
Na janela pop-up, selecione um período de tempo superior a 30 minutos dentro da fase de defasagem. Após a seleção, a linha de base aparecerá em verde no termograma. Feche a janela de seção de linha de base definida e clique em salvar e feche o software.
Em seguida, abra o aplicativo de análise de calorimetria SymCel baseado na Web. Clique em procurar para carregar o arquivo de interesse e selecione o experimento. Os parâmetros metabólicos serão calculados automaticamente para as 32 amostras.
Para encaixar os dados de fluxo de calor nos modelos Gompertz e/ou Richards Growth, clique na função de crescimento. Os modelos de crescimento serão exibidos na seção cumulativa para comparação com os dados brutos na seção de fluxo. Para baixar os parâmetros calculados, clique em medidas de download, selecione o local do arquivo e clique em salvar.
O arquivo será exportado para uma planilha para análise posterior. Aqui, são exibidos os termogramas obtidos expondo A.baumannii DSM-30008 à ciprofloxacina em diluição serial. As concentrações entre 0,005 e 0,1 micromolar têm um efeito mínimo no crescimento e metabolismo de A.baumannii.
Tratar as células com ciprofloxacina micromolar de 0,5 micromolar, no entanto, leva a uma mudança significativa na duração da fase de defasagem e a um fluxo máximo de calor mais baixo. Essas duas mudanças juntas afetam o tempo de pico, resultando em um aumento de aproximadamente seis horas. Nesta figura, o calor liberado cumulativo é plotado contra o tempo com o efeito de cada concentração refletido por uma inclinação de inclinação.
A quantificação da inclinação termograma permite o cálculo da taxa metabólica máxima de A.baumannii na presença de ciprofloxacina com uma diminuição concomitante na taxa metabólica observada em células tratadas com ciprofloxacina micromolar. O tratamento com rifampicina tem um efeito dramático nos termogramas de A.baumannii DSM-30008. Também é observada uma redução significativa da emissão de calor correlacionando-se com uma diminuição da atividade metabólica.
Observe o aumento do tempo para o pico para todas as concentrações testadas e a diminuição da taxa metabólica causada pela diminuição da inclinação para todas as concentrações que geralmente são atribuídas a um efeito bactericida. Para garantir os melhores resultados, use a tubulação reversa e evite fluidos adicionais nas laterais da inserção ao transferir a amostra, certifique-se também de que as tampas estejam devidamente fechadas.
