A principal vantagem de nossa técnica é que é uma abordagem fácil, rápida e reprodutível para a edição de genes em hepatócitos de camundongos primários como forma de gerar modelos in vitro e in vivo da doença. Usando nossa técnica, pode ser possível derrubar um gene alvo em hepatócitos isolados e, em seguida, transplantá-los de volta para o paciente, para substituir células doentes por hepatócitos editados por genes Pesquisadores inexperientes podem lutar com a cannulação e manter o cateter estável durante toda a perfusão. Os usuários são aconselhados a ler e praticar cuidadosamente o procedimento e os métodos de solução de problemas antes de começar.
Demonstrando a perfusão hepática e o isolamento da hepatocita serão Tina Parker, gerente de clínica e Ilayda Ates, assistente de pesquisa de pós-graduação. O procedimento de eletroporação será demonstrado por Callie Stuart, uma assistente de pesquisa de pós-graduação do meu laboratório. Sob um plano cirúrgico de anestesia.
Inicie a perfusão hepática fazendo uma incisão lateral em forma de U na pele do abdômen usando uma tesoura, e expanda o orifício através dos lados. Continue abrindo a pele para a caixa torácica. Usando uma tesoura, corte o peritônio para expor a cavidade abdominal até a caixa torácica.
Tomando cuidado para não roubar nenhum órgão. Mova os intestinos para o lado direito usando a parte de trás das fórceps ou a superfície cega da tesoura. Identifique a veia portal e a veia cava inferior.
Inicie a bomba para lavar a solução de perfusão pré-aquecida através do cateter. Pare a bomba e remova o cateter. Em seguida, insira a ponta da agulha conectada ao cateter na veia cava inferior em um ângulo de 10 a 20 graus na veia, remova a agulha do cateter.
Em seguida, empurre suavemente o cateter para dentro da veia em um movimento paralelo à veia. Conecte a tubulação ao cateter sem mover o cateter mais para dentro da veia. Inicie a bomba com uma taxa de fluxo de dois mililitros por minuto.
Procure o fígado imediatamente ficando pálido como um sinal de que a perfusão é bem sucedida. Corte a veia do portal usando uma tesoura. Aumente gradualmente a vazão para cinco mililitros por minuto.
Uma vez que a solução de perfusão três está fluindo através de monitorar cuidadosamente a elasticidade do fígado. Para determinar se o fígado amoleceu, pressione suavemente o fígado com um cotonete ou fórceps e verifique se as indagações se formam no fígado. Tenha cuidado para não exagerar para evitar a perda de viabilidade celular.
Uma vez que o fígado amoleça depois de 30 a 50 mililitros de solução de perfusão três fluiu, pare a bomba, remova o cateter e a vesícula biliar. Cuidado para não derramar seu conteúdo. Em seguida, dissecar cuidadosamente o fígado.
Coloque o fígado em uma placa de Petri de 100 milímetros contendo DME M gelado com meio 10%FBS. Gire a placa de Petri suavemente para remover possíveis coágulos sanguíneos. Transfira o fígado para uma nova placa de Petri contendo DME M gelado e meio 10% FBS.
Para liberar células da cápsula hepática, coloque a placa de Petri no gelo e, em seguida, usando dois pares de fórceps estéreis, rasgue suavemente a cápsula hepática em todos os lóbulos. Gire suavemente o fígado ao redor no meio usando um levantador de células para liberar os hepatócitos. Continue este movimento até que o fígado se torne muito pequeno e a suspensão fique marrom e opaca.
Remova os restos do tecido hepático da placa e usando uma pipeta sorológica de 25 mililitros definida para baixa velocidade, transfira cuidadosamente a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mililitros pré-refrigerado no gelo e equipado com um filtro de célula de 100 micrômetros. Adicione DMEM frio fresco e meio 10% FBS à placa de Petri para lavar e coletar as células restantes da superfície. Então, transfira para o tubo cônico de 50 mililitros.
Repita esta etapa até que todas as células sejam coletadas. Para lavar e purificar hepatócitos de células não parenchímicas, centrifugar as células coletadas no tubo cônico de 50 mililitros a 50 RCF a quatro graus Celsius por cinco minutos em baixa desaceleração ou sem qualquer quebra. Descarte o super-naton contendo detritos e células não parenchímicas.
Em seguida, suspenda novamente a pelota na sobra do super-naton girando suavemente o tubo. Após a suspensão da pelota adicione 30 mililitros de DMEM frio fresco e meio 10% FBS. Comece a preparar a mídia, as células e o instrumento de eletroporação CRISPR CAS 9 ligando o botão de alimentação no dispositivo de eletroporação.
Em seguida, defina o programa de eletroporação pressionando o botão X e, em seguida, o botão de seta para baixo até que o programa T 0 28 apareça na tela. Preparei os poços de destino para os hepatócitos eletroporados adicionando 1,5 mililitros de PM a seis placas bem colágenas revestidas. Incubar as placas em uma incubadora Celsius de 37 graus até estar pronta para uso.
Em tubos de tira split PCR, prepare os complexos CAS 9 RMP e mRNA, conforme descrito no manuscrito do texto. Armazene a mistura de RNA MRNA SG no gelo até a eletroporação. Separadamente, prepare um tubo contendo um micrograma de E G F P mRNA para verificar a eletroporação bem sucedida usando microscopia de fluorescência.
Centrifugar a reação de eletroporação a 100 RCF por dois minutos a quatro graus Celsius. Remova o supernaton da pelota celular e adicione 100 microliters de solução de nucleoffection por reação ao longo da lateral da parede do tubo. Suspender os hepatócitos na solução de eletroporação balançando o tubo suavemente à mão.
Uma vez que os hepatócitos são uniformemente dispersos na solução de eletroporação, transfira 100 microliters da suspensão do hepatócito para os tubos de tira contendo os nove complexos CAS. Transfira bem o conteúdo da tira para um vaso de eletroporação. Coloque o vaso nucleo-veterinário na ranhura do dispositivo de eletroporação.
Eletroporar os hepatócitos pressionando o botão X. Após a eletroporação, espere uma tela aparecer no dispositivo que diz: Ok. Pressione novamente o botão X e remova a nave.
Incubar o vaso eletroporado no gelo por 15 minutos. Adicione 500 microliters um PM pré-armado ao navio de eletroporação. Transfira 300 microliters da reação de eletroporação para cada destino bem na placa pré-aquecida.
Incubar as placas durante a noite a 37 graus Celsius. Adicione a matriz de membrana ao meio de manutenção de hepatocitste gelada e misture por tubulação para cima e para baixo 10 vezes. Remova o meio dos poços designados para análise de edição de genes 24 horas após o revestimento das células.
Pipeta a mistura de sobreposição lentamente em cima das células e coloque a placa de volta a 37 graus Celsius. Às 24 horas após o revestimento, transfira o meio condicionado do poço designado para ensaios MTT e albumina e armazene em um tubo de microfusagem até pronto para executar o ensaio albumin. Prossiga com a análise da atividade cas nove alvo, extraindo o DNA genômico e configurando o PCR conforme descrito no manuscrito do texto.
Dentro de 3 a 12 horas após o revestimento dos hepatócitos aderidos à placa e a morfologia celular assumiu uma aparência típica poligonal ou hexagonal dentro de 24 horas A pureza das células isoladas foi verificada através da coloração glicogênio usando o reagente de mudança de ácido periódico às 24 horas após o revestimento. O citoplasma dos hepatócitos manchados apareceu magenta. Os hepatócitos foram imageados 24 horas após a eletroporação e, em média, 89,8% dos hepatócitos foram positivos.
Três dias após eletroporação CAS nove induzidos no lócus hpd onde analisados e os resultados mostraram em indels alvo de 47,4% em hepatócitos eletroporados com CRISPR Cas nove mRNA e 78,4% indels para o CAS nove RNP. O ensaio MTT mostrou 35,4 e 45,9% de viabilidade em hepatócitos tratados com CRISPR Cas nove mRNA e R N P.Consistente com os resultados MTT os níveis de albumina normalizados foram de 31,8% em hepatócitos tratados com CAS nove RNA e 34,5% para CAS nove r p. O mais importante a se lembrar é que a cannulação adequada afeta todas as etapas posteriores e o sucesso do procedimento.
Após este procedimento, os hepatócitos podem ser transplantados e camundongos para investigar seus enxertos. Além disso, o DNA genômico de hepatócitos banhados pode ser extraído para analisar a eficiência e especificidade da edição cas nove.
