웨슬리 왕 박사에게 이 프로토콜과 그의 소중한 멘토링에 대한 기초를 마련해 주신 것에 감사드립니다. 이 작품은 부분적으로 건강의 국가 학회에 의해 지원되었다 (보조금 R01GM127575 및 R01GM121584) 및 웰치 재단 (그랜트 A-1715).

1. 플라스미드 건설
<ol><li>어떤 히스톤 단백질이 아세틸화되고 어떤 리신 부위를 결정할지 결정하십시오. 사이트 지시 돌연변이 발생을 사용하여 황색 정지 코돈 (TAG)에 사이트를 돌연변이. 참고: 히스톤 단백질의 발현에 활용된 4개의 이전에 디자인된 플라스미드가 있습니다. 4개의 히스톤 단백질은 모두 N-단말 히스티딘 태그로 pETDuet-1 벡터로 복제하였다. Histone H4에는 또한 SUMO 태그, 약 40의 카피 번호가 있는 복제 colE1의 기원, 암피실린 내성 및 T7 프로모터가 포함되어 있습니다.<ol>
<li>4개의 히스톤 단백질 플라스미드 중 하나에서 원하는 부위(기존 리신 코동을 호박스톱 코돈으로 교체)에서 TAG 돌연변이를 포함하는 전방 및 역프라이머를 설계한다.</li>
		<li>플라스미드가 포함된 태그를 증폭시키기 위해 전체 플라스미드 PCR을 사용합니다. 프라이머에 적합한 어닐링 온도를 결정합니다. 일반적으로, 프라이머의 용융온도(Tm)는5°C를 뺀 값으로 충분할 것이다. 어려움이 PCR 생성물을 얻는 데 어려움이 있는 경우, Tm-5°C 주위의 온도 그라데이션을 사용하여 증폭을 위한 어닐링 온도를 최적화할 수 있습니다. 참고:본 실험에서 사내 발현PFU 폴리머라제는 30초(데니션레이션), 30초동안 의 온도 34°C, 6분 동안 72°C(또는 킬로베이스 쌍당 1분)를 사용하여 30사이클에 사용되었다. PCR 방법의이 유형에 대한 자세한 내용은 리우와 나이 스미스7을참조하십시오.</li>
		<li>제조업체의 프로토콜을 따라 PCR 정리 키트로 PCR 제품을 정리합니다. 아가로즈 젤 전기포진및 후속 에디튬 브로마이드 염색에 의해 PCR 제품을 분석한다.</li>
		<li>16°C에서 하룻밤 사이에 T4 리게아제로 배양하여 플라스미드를 리게이트합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>먼저 플라스미드(AmpR)를함유한 태그를 화학적으로 유능한 대장균으로 변환한다. 변환에서 최소 4 개의 식민지를 선택하고 플라스미드를 정화합니다. 표준 방법을 사용하여 글리세롤을 사용하여 각각의 세포 주식을 만들고 -80 °C에 보관하십시오. 원하는 TAG 돌연변이를 확인하기 위해 시퀀싱을 위해 보냅니다.</li>
	<li>시퀀스가 확인되면, PEVOL-AckRS(ChlR)를사용하여 태그 함유 플라스미드(AmpR)를화학적으로 유능한 CobB로 공동 변환합니다(대장균에 알려진 유일한 히스톤 리신 deacetylase)을 열 쇼크 방법을 사용하여 BL21 세포를 삭제한다. pEVOL은 낮은 복사 번호 p15A 원점으로 중간 복사 번호가 있는 플라스미드입니다. 참고: 플라스미드의 pEVOL 시리즈는 정형간 aaRS/tRNA티르 쌍의 증가발현을 보여 준 이전 연구를 기반으로 생성되었으며 단백질 잘림을 감소시키고 돌연변이단백질8의 전반적인 수율을 증가시키는 데 효과적이었다. CobB 삭제 세포가 접근할 수 없는 경우 화학적으로 유능한 BL21 세포를 진행하십시오. CobB는 시르투인과 같은 히스톤 리신 데아실라제와 니코티닌아미드를 5mM 최종 농도로 첨가하여 CobB를 대체접근법9로억제할 수 있다.</li>
	<li>셀 스톡을 만들고 -80 °C에 보관하십시오.</li>
</ol>2. 아세틸화 히스톤 단백질 발현
<ol><li>문화 플라스크에서 오토클레이브 2YT 미디어(또는 선택량)의 L 1L을 준비합니다.</li>
	<li>태그 함유 플라스미드(AmpR)및 pEVOL-AckRS(ChlR)를가지는 공동 변형된 세포 육수와 적절한 항생제를 함유하고 있으며, 37°C에서 OD=0.6(4-6h)으로 성장시키는 2YT 매체의 20mL을 접종한다.</li>
	<li>20mL 스타터 배양으로 1L의 오토클레이브 2YT 배지에 적절한 항생제를 추가하고 접종한다. 37°C에서 OD = 0.6-0.8(2-3h)으로 성장한다.</li>
	<li>IPTG 1 mM, 0.2% 아라비노스 및 AcK 5 mMM의 최종 농도에 유도 제및 아세틸리신(AcK)을 첨가합니다.</li>
	<li>6-8 h에 대한 37 °C에서 배양 성장.</li>
	<li>펠릿 셀은 15 분 동안 2,700 x g에서. </li>
	<li>셀 펠릿을 하룻밤 -80°C에 보관합니다.</li>
	<li>이 단계에서부터 는 항상 얼음에 샘플을 유지합니다. 세포의 1L당 히스톤 용해 버퍼의 50mL에 셀 펠릿을 용해시키십시오.</li>
	<li>다음 주기에 따라 초음파 처리: 1 에, 1 s off, 정시에 총: 3 분 에 60% 진폭.</li>
	<li>펠릿 포함 바디 41,600 x g 45 분 동안.</li>
	<li>상체를 버리고 포함 바디를 히스톤 리시스 버퍼의 30mL로 재일시 중단합니다. 펠릿 포함 몸통은 41,600 x g에서 30 분 동안.</li>
	<li>상체를 버리고 펠릿 세척 버퍼의 30 mL에 포함 시체를 다시 중단합니다. 펠릿 포함 바디는 41,600 x g에서 30 분 동안.</li>
	<li>6M 구아니딘 염산염(GuHCl) 버퍼의 25mL에 초상체를 폐기하고 포함 체체를 용해한다. 1 h에 대 한 37°C에서 교반으로 배양. 참고: 필요한 경우 포함 바디는 4°C에서 하룻밤 사이에 교반으로 배양될 수 있습니다.</li>
	<li>펠릿 포함 몸통 41,600 x g 45 분. 2h에 대한 6 M GuHCl 버퍼와 함께 평형 Ni-NTA 수지의 1 mL와 상류층을 배양.</li>
	<li>변성 조건하에서 Ni-NTA 정화를 진행합니다. 열 세척 버퍼의 3 열 볼륨으로 열을 세척합니다. 엘루테 아세틸리히스톤 단백질10mL용출버퍼. 참고 : 여기에 단백질을 집중하려고 시도하는 것은 옵션이지만 아세틸화 된 히스톤은 매우 예측할 수 없으며 쉽게 침전 할 수 있습니다. 총 부피 2mL를 지나서 집중하지 않는 것이 좋습니다.</li>
	<li>염을 제거하기 위해 5 % 아세트산 버퍼에 대한 아세틸화 히스톤 단백질을 광범위하게 투석합니다. 4°C에서 한 번에 3시간 동안 투석하여 최소 6회 신선한 버퍼로 교환합니다. 참고: 단백질 순도향상을 위해 순수한 물과 투석을 할 수 있는 옵션이 있습니다. 그러나, 이것은 낮은 항복 아세틸화 히스톤 단백질에 대 한 바람직하지 않을 수 있습니다 수율에 상당한 강수량 및 감소를 일으키는 원인이.</li>
	<li>알리쿼트와 리오필화 단백질을 - 80°C에서 무기한 보관하십시오. 야생 형 히스톤 단백질은 일반적으로 10-50 mg /L을 산출하는 반면 아세틸화 히스톤 단백질은 특정 lysine 부위에 따라 10 mg / L 미만을 산출합니다. 예를 들어, H3K79Ac 평균 5 mg/L.</li>
</ol>3. 와일드 타입 히스톤 단백질 발현
<ol><li>전체 뉴클레오좀을 조립하려면 4개의 히스톤 단백질을 모두 표현하십시오. 야생 형 히스톤을 표현하고 정화 할 때 프로토콜은 다음을 제외하고 아세틸화 된 히스톤과 동일합니다.<ol>
<li>공동 변환을 수행하지 마십시오. 야생 형 히스톤 표현에 pEVOL-AcKRS를 사용하지 마십시오. 그에 따라 항생제를 조정합니다.</li>
		<li>세포 발현을 유도하는 동안 CobB 삭제 세포주를 사용하거나 니코티나미드, AcK 또는 아라비노스를 추가하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 601 DNA 준비
참고: 이전에 설계된 최적화된 DNA 서열이 핵분포지셔닝을 지시하여 히스톤 옥타머로 조립되어 고효율의 단핵구를 생성합니다. 이 서열은 601 DNA 또는 Widom 서열이라고 합니다. 이 서열은 크로마티닌 리모델링 소세포에서 단일 분자측정(10)에이르는 뉴클레오좀의 체외 연구를 위한 표준 DNA 서열이 되었다.
<ol><li>뉴클레오소성 어셈블리를 위한 601 DNA의 상당량을 준비하려면 pGEM-3z/601을 상위 10개 세포로 변환하고 플라스미드 증폭 및 추출을 위한 10mL의 배양을 성장시킨다. 플라스미드 추출 키트를 사용하고 제조업체의 권장 사항을 따르십시오.</li>
	<li>이 증폭 프로토콜에 대해 사내 발현 PFU 폴리머라제(보다 효율적)를 사용하십시오. PCR 반응 설정: 250 μL 반응의 경우 207.5 μL 오토클레이브 MQ H2O, 25 μL 10x PFU 버퍼, 5 μL 포워드 프라이머: ctggagaatcccggtgccg, 5 μL 역 프라이머: 아카게타타트타트ctgacacg, 5μL dNTP 믹스, 2.5 μL PFU를 사용하십시오. 우리는 일반적으로 조립하기에 충분한 DNA를 얻기 위하여 한 번에 60의 반응을 실행합니다.</li>
	<li>PFU 폴리머라아제사용시 30s의 연장 시간 동안 52°C의 어닐링 온도를 사용하고 30s의 연장 시간을 사용한다. 그렇지 않으면 제조업체권장 조건을 따릅니다.</li>
	<li>PCR이 완료되면 PCR 제품을 정화하기 위해 선택한 PCR 정리 키트를 사용합니다.</li>
</ol>5. 히스톤 옥타머 의 조립
<ol><li>히스톤 단백질 펠릿 H2A, H2B, H3 및 H4의 알리쿼트를 용해하여 GuHCl 버퍼에 각 히스톤 단백질의 별도의 재고가 100 μL의 총 부피를 가지게 된다.</li>
	<li>A280 흡광도를 측정하여 각 히스톤 단백질의 농도를 계산합니다.</li>
	<li>흡수율이 단백질에 대해 1보다 크면 GuHCl 버퍼로 희석하여 보다 정확한 농도를 얻습니다.</li>
	<li>H2A와 H2B 단백질을 1:1 어어 비율로 결합하고 총 단백질 농도4 μg/μL로 희석합니다.</li>
	<li>하룻밤 동안 2M TE 버퍼에 대해 4 °C에서 순차적으로 투석하고, 2 h용 1 M TE 버퍼, 5 h용 0.5 M TE 버퍼. 참고: 투석의 두 번째 및 세 번째 단계는 단백질의 불안정한 적합성을 유발하여 밖으로 침전시합니다. 이 단계에서 무거운 강수량을 볼 것으로 예상된다.</li>
	<li>4°C에서 16,800 x g에서 원심분리로 침전을 제거합니다.</li>
	<li>다시, A280 흡광도를 측정하는 히스톤 디머(H2A/H2B 혼합물) 및 테트라머(H3/H4 혼합물)의 농도를 계산한다.</li>
	<li>1:1 어어 비율로 디머와 테트라머를 혼합하고 솔리드 NaCl을 추가하여 NaCl에서 2M로 조정합니다.</li>
	<li>히스톤 옥타머는 4°C에서 보관할 수 있으며 디머와 테트라머보다 더 안정적입니다. 이 분해를 일으킬 수 있으므로 히스톤 옥타머를 동결하지 마십시오.</li>
	<li>아세틸화 히스톤으로 조립하는 경우 야생 단백질을 절차에서 아세틸화 단백질로 교체하기만 하면 됩니다.</li>
</ol>6. 뉴클레오소이스 어셈블리
<ol><li>100x TE 버퍼와 솔리드 NaCl을 사용하여 601 DNA를 2M TE 버퍼로 조정합니다. 0.85:1 ~0.90:1의 어금니 비율로 히스톤 옥타머에 2M TE 버퍼로 601 DNA를 추가합니다. 무료 DNA가 젤 시프트 분석에 존재하는 경우 DNA의 낮은 비율이 추가될 수 있다.</li>
	<li>DNA-히스톤 혼합물을 투석 봉투를 옮기고 약 200mL의 2M TE 버퍼(또는 여러 샘플을 조립하는 경우) 4°C에서 매우 부드럽게 저어줍니다.</li>
	<li>연동 펌프를 설정하여 소금 TE 버퍼없이 천천히 떨어 뜨립니다. 볼륨이 약 두 배가되면 볼륨의 절반을 부어 넣습니다. 총 4회 이상 이 작업을 수행합니다. 펌프를 사용하면 시작 볼륨에 따라 4-8 h가 걸릴 수 있습니다. 핵소는 염분 농도가 150mMM로 감소될 때 형성됩니다(염도 계측기로 측정).</li>
	<li>염 농도가 150mM로 감소한 후 밤새 20mM TE 버퍼에 대해 투석한다.</li>
	<li>원심분리에 의한 침전을 제거하고 플레이트 판독기를 사용하여 A260 을 판독하여 뉴클레오좀의 농도를 측정한다.</li>
	<li>그의-TEV 프로테아제 (TEV를 추가 : 뉴클레오소1:30, w :w) 모든 히스티딘 태그를 제거하기 위해 4 ° C에서 하룻밤 배양. Ni-NTA 수지풀다운에 의한 뉴클레오소성 용액으로부터 히스티딘 태그 불순물을 제거합니다.</li>
	<li>뉴클레오좀을 배치하고 시료를 균질화하기 위해, 1 h에 대해 60°C에서 배양한다. 참고: 특히 불안정한 아세틸화된 사이트의 경우 이 단계를 권장하지 않을 수 있습니다.</li>
	<li>4°C에서 단기(몇 주)에 뉴클레오좀을 저장한다.</li>
	<li>장기 저장을 위해, 저장 버퍼에 대한 뉴클레오좀을 투석하고 -80 °C에 저장합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Srinivasan, G., James, C. M., Krzycki, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrrolysine+encoded+by+UAG+in+Archaea:+Charging+of+a+UAG-Decoding+specialized+tRNA.">Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: Charging of a UAG-Decoding specialized tRNA.</a> Science. 296 (5572), 1459-1462 (2002).</li><li>Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. 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저자중 누구도 선언할 경쟁적인 재정적 이해관계는 없습니다.

실험 중에 이 프로토콜을 모든 세부 사항으로 따르는 것이 필수적입니다. 뉴클레오좀은 매우 안정적이지 않으며 많은 시행착오가 이 프로토콜을 결정하는 데 들어갔습니다. 미립자가 조립 공정을 쉽게 방해할 수 있기 때문에 모든 단계(또는 관찰 될 때마다)에서 침전을 제거하는 것이 중요합니다. 항상 얼음에 히스톤 샘플을 유지합니다. 뉴클레오좀이 너무 오래 4°C로 저장되면 자발적으로 분해?...

우리는 PylRS와 tRNAPyl을 사용하여 사이트 특정 아세틸화 히스톤으로 재구성된 단핵구를 합성하고 조립했습니다. PylRS는 포스트 번역 변형 (PTM)을 가진 단백질을 생성하는 유전 코드 확장 도구로 귀중한 입증하고 약 200 다른 ncAA를 통합하기 위해 유전적으로 진화되었습니다. PylRS는 호박색 정지 코돈에 통합되어 번역 중에 다른 아미노산에서 경쟁을 제거합니다. PylRS는 메탄원성 고고학에서 처음 발견되었으며, 이후 화학 생물학에서 새로운 반응성 화학 그룹을 단백질1,2에통합하는 데 활용되었습니다.
MmAcKRS1은 메타노사르키나 미제이 PylRS로부터 진화하고 아세틸화된 단백질3,4,5,6의합성을 위해 실험실에서 자주 사용되었다. MmAcKRS1은 대장균에서 번역하는 동안 선택되는 mRNA에 있는 호박색 돌연변이 부위에서 AcK를 전달한다. 이 기술은 이전에 K4, K9, K14, K18, K23, K27, K36, K56, K64, K79 히스톤 H3 리신 부위에 AcK를 통합하여 1, 2, 6, 7의 아세트 모노뉴클레오솜4,5,6의AcK를 통합하는 데 사용되었습니다. 여기서 우리는 아세틸화 된 히스톤을 발현하고 아세틸화 뉴클레오좀을 재구성하는이 방법을 자세히 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M TE Buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M TE Buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x TE Buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 M TE Buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mM TE Buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 M GuHCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6M guanidinium chloride, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyllysine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column Wash Buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazole pH 7.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Variable-Flow Chemical Transfer Pump</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>15-077-67</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-TEV protease</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histone Lysis Buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Resin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 7.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Clean-Up Kit</td>
			<td>Epoch Life Sicences</td>
			<td>2360050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet Wash Buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petDUET-His-SUMO-TEV-H4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petDUET-His-TEV-H2A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petDUET-His-TEV-H2B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petDUET-His-TEV-H3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEVOL-AckRS</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>137976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEM-3z/601</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>26656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage Buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glycerol, pH 7.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

site specific lysine acetylation of histones for nucleosome reconstitution using genetic code expansion in escherichia coli

아세틸화 히스톤 단백질은 돌연변이, N ε-아세틸-리신(AcK)-특이적 메타노사르시나 마지 피롤리신 tRNA-synthetase(MmAcKRS1) 및 그 코그네이트 tRNA(tRNAPyl)를결합하여 재구성한 단핵형 특이적 군수로 재구성할 수 있는 에셀리치아 대장균에서 용이하게 발현될 수 있다. MmAcKRS1 및 tRNAPyl은 대장균에서 번역하는 동안 선택되는 mRNA에 있는 황색 돌연변이 부위에서 AcK를 전달한다. 이 기술은 H3 lysine 사이트에 AcK를 통합하는 데 광범위하게 사용되었습니다. Pyrrolysyl-tRNA synthetase (PylRS)는 또한 사이트 특정 단백질 수정 또는 기능화를 위한 다른 비카노마이컬 아미노산(ncAA)을 통합하도록 쉽게 진화될 수 있다. 여기서 우리는 MmAcKRS1 시스템을 사용하여 AcK를 히스톤 H3에 통합하고 아세틸화 된 H3 단백질을 재구성 된 단핵구로 통합하는 방법을 자세히 설명합니다. 아세틸화 재구성 된 단핵구는 생화학 적 및 결합 적 반응, 구조 결정 등에 사용될 수 있습니다. 수정된 단핵구를 얻는 것은 새로운 상호 작용을 발견하고 후성 유전학을 이해하는 관련있는 실험을 디자인하기 위해 중요합니다.

디머, 테트라머 및 옥타머는 12% SDS PAGE젤(그림 1 및 도 2)을실행하여 평가할 수 있다. 여기서 당신은 아세틸화 테트라머중 일부가 다른 테트라머보다 낮은 수율을 가지고 있음을 알 수 있습니다(그림 1). 사실, 코어 영역에 가까울수록 수율이 낮아집니다. 이것은 가장 가능성이 있기 때문에 테트라머의 조립?...

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Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

여기서 우리는 유전 코드 확장을 사용하여 아세틸화 히스톤 단백질을 발현하고 체외에서 재구성된 뉴클레오좀을 조립하는 방법을 제시한다.

에체리치아 대장균의 유전코드 확장을 이용한 뉴클레오소성 재구성을 위한 히스톤의 특정 리신 아세틸화

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...

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Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Unit 1

Structure and Organization of DNA

SCIENTISTS IN ACTION

3.9K 조회수.  Texas A&M University. 여기서 우리는 유전 코드 확장을 사용하여 아세틸화 히스톤 단백질을 발현하고 체외에서 재구성된 뉴클레오좀을 조립하는 방법을 제시한다.

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Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique applications for OMV where traditional nanoparticles are proving too difficult to synthesize. To date, all Gram-negative bacteria have been shown to produce OMV demonstrating packaging of a variety of cargo that includes small molecules, peptides, proteins and genetic material. Based on their diverse cargo, OMV are implicated in many biological processes ranging from cell-cell communication to gene transfer and delivery of virulence factors depending upon which bacteria are producing the OMV. Only recently have bacterial OMV become accessible for use across a wide range of applications through the development of techniques to control and direct packaging of recombinant proteins into OMV. This protocol describes a method for the production, purification, and use of enzyme packaged OMV providing for improved overall production of recombinant enzyme, increased vesiculation, and enhanced enzyme stability. Successful utilization of this protocol will result in the creation of a bacterial strain that simultaneously produces a recombinant protein and directs it for OMV encapsulation through creating a synthetic linkage between the recombinant protein and an outer membrane anchor protein. This protocol also details methods for isolating OMV from bacterial cultures as well as proper handling techniques and things to consider when adapting this protocol for use for other unique applications such as: pharmaceutical drug delivery, medical diagnostics, and environmental remediation.

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

에서 외부 막 소포 내에서 감독 단백질 포장<em&gt; 대장균</em&gt; : 디자인, 생산 및 정제

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

연구

생화학

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many of these conditions cause protein unfolding in the cell and have detrimental impact on the survival of the organism. A group of unrelated, stress-specific molecular chaperones have been shown to play essential roles in the survival of these stress conditions. While fully folded and chaperone-inactive before stress, these proteins rapidly unfold and become chaperone-active under specific stress conditions. Once activated, these conditionally disordered chaperones bind to a large number of different aggregation-prone proteins, prevent their aggregation and either directly or indirectly facilitate protein refolding upon return to non-stress conditions. The primary approach for gaining a more detailed understanding about the mechanism of their activation and client recognition involves the purification and subsequent characterization of these proteins using in vitro chaperone assays. Follow-up in vivo stress assays are absolutely essential to independently confirm the obtained in vitro results.
This protocol describes in vitro and in vivo methods to characterize the chaperone activity of E. coli HdeB, an acid-activated chaperone. Light scattering measurements were used as a convenient read-out for HdeB&#39;s capacity to prevent acid-induced aggregation of an established model client protein, MDH, in vitro. Analytical ultracentrifugation experiments were applied to reveal complex formation between HdeB and its client protein LDH, to shed light into the fate of client proteins upon their return to non-stress conditions. Enzymatic activity assays of the client proteins were conducted to monitor the effects of HdeB on pH-induced client inactivation and reactivation. Finally, survival studies were used to monitor the influence of HdeB&#39;s chaperone function in vivo.

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

This study describes biophysical, biochemical and molecular techniques to characterize the chaperone activity of Escherichia coli HdeB under acidic pH conditions. These methods have been successfully applied for other acid-protective chaperones such as HdeA and can be modified to work for other chaperones and stress conditions.

의 pH에 ​​의존 활동의 검출<em&gt; 대장균</em&gt; 보호자 HdeB<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Efficient and Site-specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition

There are currently many chemical tools available to introduce chemical probes into proteins to study their structure and function. A useful method is protein conjugation by genetically introducing an unnatural amino acid containing a bioorthogonal functional group. This report describes a detailed protocol for site-specific antibody conjugation. The protocol includes experimental details for the genetic incorporation of an azide-containing amino acid, and the conjugation reaction by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC). This strain-promoted reaction proceeds by simple mixing of the reacting molecules at physiological pH and temperature, and does not require additional reagents such as copper(I) ions and copper-chelating ligands. Therefore, this method would be useful for general protein conjugation and development of antibody drug conjugates (ADCs).

Here, we present a protocol to site-specifically introduce chemical probes into an antibody fragment by genetically incorporating an azide-containing amino acid, and subsequently coupling the azide with a chemical probe by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC).

효율적이고 사이트 별 스트레인 승진 아 지드 - 알킨 사이클로에 의해 항체 라벨링

There are currently many chemical tools available to introduce chemical probes into proteins to study their structure and function. A useful method is ...

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications (PTMs). They are newly identified species with unknown means of establishment and functional implications. Current analytical methods are inadequate to detect the copy-specific occurrence of PTMs on the nucleosomal sister histones. This protocol presents a biochemical method for the in vitro reconstitution of nucleosomes containing differentially isotope-labeled sister histones. The generated complex can be also asymmetrically modified, after including a premodified histone pool during refolding of histone subcomplexes. These asymmetric nucleosome preparations can be readily reacted with histone-modifying enzymes to study modification cross-talk mechanisms imposed by the asymmetrically pre-incorporated PTM using nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Particularly, the modification reactions in real-time can be mapped independently on the two sister histones by performing different types of NMR correlation experiments, tailored for the respective isotope type. This methodology provides the means to study crosstalk mechanisms that contribute to the formation and propagation of asymmetric PTM patterns on nucleosomal complexes.

This protocol describes the reconstitution of nucleosomes containing differentially isotope-labeled sister histones. At the same time, asymmetrically post-translationally modified nucleosomes can be generated after using a premodified histone copy. These preparations can be readily used to study modification crosstalk mechanisms, simultaneously on both sister histones, by using high-resolution NMR spectroscopy.

된 유의 동위 원소 표지 자매 히스톤과 뉴 클레오의 재구성

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. The relative levels of different tRNAs, and the ratio of aminoacylated tRNA to total tRNA, known as the charging level, are important factors in determining the accuracy and speed of translation. Therefore, the abundance and charging levels of tRNAs are important variables to measure when studying protein synthesis, for example under various stress conditions. Here, we describe a method for harvesting tRNA and directly measuring both the relative abundance and the absolute charging level of specific tRNA species in Escherichia coli. The tRNA is harvested in such a way that the labile bond between the tRNA and its amino acid is preserved. The RNA is then subjected to gel electrophoresis and Northern blotting, which results in separation of the charged and uncharged tRNAs. The levels of specific tRNAs in different samples can be compared due to the addition of spike-in cells for normalization. Prior to RNA purification, we add 5% of E. coli cells that overproduce the rare tRNAselC to each sample. The amount of the tRNA species of interest in a sample is then normalized to the amount of tRNAselC in the same sample. Addition of spike-in cells prior to RNA purification has the advantage over addition of purified spike-in RNAs that it also accounts for any differences in cell lysis efficiency between samples.

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Here we present a method for directly measuring transfer RNA charging levels from purified Escherichia coli RNA as well as a way to compare relative levels of transfer RNA, or any other short RNA, across different samples based on the addition of spike-in cells expressing a reference gene.

풍부 하 고 대장균 에서 전송 RNAs의 레벨 충전의 정량화

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts of recombinant RNAs are limited. Here, we describe a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli based on co-expression of a chimeric molecule that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. Viroids are relatively small, non-coding, highly base-paired circular RNAs that are infectious to higher plants. The host plant tRNA ligase is an enzyme recruited by viroids that belong to the family Avsunviroidae, such as Eggplant latent viroid (ELVd), to mediate RNA circularization during viroid replication. Although ELVd does not replicate in E. coli, an ELVd precursor is efficiently transcribed by the E. coli RNA polymerase and processed by the embedded hammerhead ribozymes in bacterial cells, and the resulting monomers are circularized by the co-expressed tRNA ligase reaching a remarkable concentration. The insertion of an RNA of interest into the ELVd scaffold enables the production of tens of milligrams of the recombinant RNA per liter of bacterial culture in regular laboratory conditions. A main fraction of the RNA product is circular, a feature that facilitates the purification of the recombinant RNA to virtual homogeneity. In this protocol, a complementary DNA (cDNA) corresponding to the RNA of interest is inserted in a particular position of the ELVd cDNA in an expression plasmid that is used, along the plasmid to co-express eggplant tRNA ligase, to transform E. coli. Co-expression of both molecules under the control of strong constitutive promoters leads to production of large amounts of the recombinant RNA. The recombinant RNA can be extracted from the bacterial cells and separated from the bulk of bacterial RNAs taking advantage of its circularity.

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Here, we present a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli by co-expressing a chimeric RNA that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. The main product is a circular molecule that facilitates purification to homogeneity.

대장균 에서 바이로이드 파생 시스템을 사용 하 여 원형 발판에 재조합 RNAs의 대규모 생산

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic acid (sRNA) molecules and target messenger RNAs (mRNAs). In addition, site-directed mutagenesis is used to map specific protein binding sites to RNA. A 2-step and 3-step PCR based introduction of mutations is described. The approach is relevant to all protein-RNA and RNA-RNA interaction studies. In short, the technique relies on designing primers with the desired mutation(s), and through 2 or 3 steps of PCR synthesizing a PCR product with the mutation. The PCR product is then used for cloning. Here, we describe how to perform site-directed mutagenesis with both the 2- and 3-step approach to introduce mutations to the sRNA, McaS, and the mRNA, csgD, to investigate RNA-RNA and RNA-protein interactions. We apply this technique to investigate RNA interactions; however, the technique is applicable to all mutagenesis studies (e.g., DNA-protein interactions, amino-acid substitution/deletion/addition). It is possible to introduce any kind of mutation except for non-natural bases but the technique is only applicable if a PCR product can be used for downstream application (e.g., cloning and template for further PCR).

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in deoxyribonucleic acid (DNA). This protocol describes how to do site-directed mutagenesis with a 2-step and 3-step polymerase chain reaction (PCR) based approach, which is applicable to any DNA fragment of interest.

사이트 감독 Mutagenesis에 대 한 생체 외에서 그리고 Vivo 실험 대장균 RNA 상호 Exemplified에서

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination of chromatin function and DNA-associated processes. This modification involves a sequential action of several enzymes including E1 ubiquitin-activating, E2 ubiquitin-conjugating and E3 ubiquitin-ligase and is reversed by deubiquitinases (DUBs). Ubiquitination induces degradation of proteins or alteration of protein function including modulation of enzymatic activity, protein-protein interaction and subcellular localization. A critical step in demonstrating protein ubiquitination or deubiquitination is to perform in vitro reactions with purified components. Effective ubiquitination and deubiquitination reactions could be greatly impacted by the different components used, enzyme co-factors, buffer conditions, and the nature of the substrate.&#160; Here, we provide step-by-step protocols for conducting ubiquitination and deubiquitination reactions. We illustrate these reactions using minimal components of the mouse Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), BMI1, and RING1B, an E3 ubiquitin ligase that monoubiquitinates histone H2A on lysine 119. Deubiquitination of nucleosomal H2A is performed using a minimal Polycomb Repressive Deubiquitinase (PR-DUB) complex formed by the human deubiquitinase BAP1 and the DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD) domain of its co-factor ASXL2. These ubiquitination/deubiquitination assays can be conducted in the context of either recombinant nucleosomes reconstituted with bacteria-purified proteins or native nucleosomes purified from mammalian cells. We highlight the intricacies that can have a significant impact on these reactions and we propose that the general principles of these protocols can be swiftly adapted to other E3 ubiquitin ligases and deubiquitinases.

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in cellular processes and is tightly coordinated by deubiquitination. Defects in both reactions underlie human pathologies. We provide protocols for conducting ubiquitination and deubiquitination reaction in vitro using purified components.

체외 유비퀴틴화 및 뉴클레오소말 히스톤의 이중화 율법의 비퀴틴화 어설션

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein aggregation. The accumulation of protein aggregates in bacterial cells can lead to significant alterations in the cellular phenotypic behavior, including a reduction in growth rates, stress resistance, and virulence. Several experimental procedures exist for the examination of these stressor-mediated phenotypes. This paper describes an optimized assay for the extraction and visualization of aggregated and soluble proteins from different Escherichia coli strains after treatment with a silver-ruthenium-containing antimicrobial. This compound is known to generate reactive oxygen species and causes widespread protein aggregation. 
The method combines a centrifugation-based separation of protein aggregates and soluble proteins from treated and untreated cells with subsequent separation and visualization by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Coomassie staining. This approach is simple, fast, and allows a qualitative comparison of protein aggregate formation in different E. coli strains. The methodology has a wide range of applications, including the possibility to investigate the impact of other proteotoxic antimicrobials on in vivo protein aggregation in a wide range of bacteria. Moreover, the protocol can be used to identify genes that contribute to increased resistance to proteotoxic substances. Gel bands can be used for the subsequent identification of proteins that are particularly prone to aggregation.

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

This protocol describes the extraction and visualization of aggregated and soluble proteins from Escherichia coli after treatment with a proteotoxic antimicrobial. Following this procedure allows a qualitative comparison of protein aggregate formation in vivo in different bacterial strains and/or between treatments.

프로테오독성 스트레스로 대장균 치료 후 단백질 골재의 추출 및 시각화

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...

Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble effectively in vitro. Such complexes may require co-translational assembly and the presence of molecular chaperones; either they form stable oligomers which cannot dissociate and re-associate in vitro or are unstable without a binding partner. To overcome these problems, it is possible to use a method based on the bacterial co-expression of differentially tagged proteins using a set of compatible vectors followed by the conventional pulldown techniques. The workflow is more time-efficient compared to traditional pulldown because it lacks the time-consuming steps of separate purification of interacting proteins and their following incubation. Another advantage is a higher reproducibility due to a significantly smaller number of steps and a shorter period of time in which proteins that exist within the in vitro environment are exposed to proteolysis and oxidation. The method was successfully applied for studying a number of protein-protein interactions when other in vitro techniques were found to be unsuitable. The method can be used for batch testing protein-protein interactions. Representative results are shown for studies of interactions between BTB domain and intrinsically disordered proteins, and of heterodimers of zinc-finger-associated domains.

Here, we describe a method for the bacterial co-expression of differentially tagged proteins using a set of compatible vectors, followed by the conventional pulldown techniques to study protein complexes that cannot assemble in vitro.

까다로운 단백질-단백질 상호작용을 테스트하기 위한 시간 효율적인 도구로서 박테리아 세포의 공동 발현과 결합된 풀다운 분석

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...