Este fluxo de trabalho de dissecção e análise de todo o montagem fornece uma nova abordagem para analisar a morfologia completa das arboris nervosas de paladar individuais, transduzindo números do tipo celular e as relações físicas entre as células. Coletar todo o epitélio lingual nos permite medir o número absoluto de células e o volume de inervação dentro de toda a papila gustativa. Essa abordagem é mais precisa do que as estimativas da estrutura celular com base na amostragem de seções, o que reduz a variabilidade técnica.
Este também é o primeiro método que fornece análise detalhada das células gustativas em relação à sua inervação. Esse método pode aprimorar investigações sobre os circuitos potenciais dentro da papila gustativa, bem como processos de doenças e quimioterápicos que interrompem a função normal do sabor. Na maioria desses casos, não está claro qual estrutura ou relacionamento é interrompido, então manter todos esses fatores intactos permite todas as análises dentro de uma única preparação.
O erro mais comum é tentar evitar danificar o epitélio por não dissecar perto o suficiente da parte inferior do epitélio. É imperativo remover o máximo de tecido subjacente possível antes de congelar o tecido no molde do tecido. Também é importante garantir que o epitélio esteja na parte inferior do molde do tecido.
Comece descongelando e enxaguando a língua em 0,1 tampão molar fosfato. Em seguida, coloque 1/2 da língua anterior contendo as papilas fungiformes em um deslizamento de vidro sob um microscópio dissecando. Use fórceps e tesouras de dissecção para remover o músculo e mantenha o tecido aberto à medida que o epitélio lingual é curvo, garantindo uma orientação plana do tecido mantendo as lâminas da tesoura de dissecção grosseira paralela à epitélio.
Descarte o epitélio ventral não queratinizado da língua, pois não contém papilas gustativas. Em seguida, use uma tesoura de dissecção fina para dissecção mais próxima à parte inferior do epitélio queratinizado. Use fórceps sem corte para colocar um pedaço de epitélio em um molde de tecido e garantir que ele se deite plano.
Em seguida, adicione uma gota de composto de temperatura de corte ideal, ou OCT, ao tecido. Coloque o molde de tecido em uma base metálica previamente resfriada sob o escopo de dissecação, em seguida, continue a tocar o tecido levemente com os fórceps até que o OCT tenha congelado, garantindo que o tecido congele o mais plano possível. Uma vez que o OCT tenha congelado, adicione rapidamente oct adicional e coloque o molde em um béquer de 2-metilbutano resfriado até congelar.
Monte o molde OCT no criostat e corte-o em seções de 20 mícrons. Colete cada seção e visualize-a sob o microscópio de luz para avaliar sua proximidade com a base do epitélio. Depois que o tecido for raspado da parte inferior do epitélio, descongele o epitélio e enxágue-o duas vezes em 0,1 pb molar em um agitador.
Corte o paladar duro anterior à junção do paladar macio e duro, em seguida, separe o paladar macio do tecido subjacente, certificando-se de que quaisquer fragmentos ósseos restantes sejam cortados e removendo músculos adicionais e tecido conjuntivo. Segure o paladar com fórceps sem corte e remova as glândulas restantes e perca tecido conjuntivo raspando-os suavemente com uma lâmina de barbear. Botões de paladar inteiros e toda a inervação do paladar em camundongos Phox2b-Cre TdTomato foram rotulados pela coloração do epitélio lingual com anticorpos para DsRed e queratina oito.
O volume da papila gustativa foi medido e não revelou correlações entre volumes de paladar e volumes de inervação nas regiões de medição de fungos ou circunvalladas. A administração de uma baixa dose de tamoxifen em camundongos TrkB CreER TdTomato causa recombinação genética e rotulagem de um pequeno número de neurônios. Uma papila gustativa de montagem inteira manchada com marcadores celulares transdutores de sabor, anidrato 4 e fosfolipase C beta dois é mostrado aqui.
Esta papila gustativa tem duas arbors terminais rotuladas, que são mostradas com a papila gustativa removida após a reconstrução das fibras. O uso de um software de imagem baseado em pixels celulares para determinar a proximidade mais próxima entre fibras nervosas e células transdutoras de sabor revelou que de 19 células transdutoras de sabor, a árvore terminal azul estava dentro de 200 nanômetros da anidrádrada carbonoica azul clara quatro mais células. A árvore terminal associada ao rastreamento verde é mostrada em magenta e está dentro de 200 nanômetros da anidrádrada carbonoica azul clara e escura quatro células.
A queratina de montagem total oito e 5-ethynyl-2'deoxyuridina ou a coloração da EdU de papilas gustativas fungiformes revelaram que as células rotuladas pela EdU estavam presentes dentro e fora das papilas gustativas. Os núcleos magenta e roxo são observados fora da queratina oito mais borda da papila gustativa. As células amarelas, teal e azul estavam dentro da papila.
Ao tentar este protocolo, a dissecção tecidual e as etapas de congelamento são cruciais. Esses métodos de dissecção tecidual podem ser seguidos pela coloração de uma variedade de células e estruturas para analisar as relações dentro da papila gustativa e fora da papila gustativa, mas dentro da papila. Esta é a primeira análise de arbors de gosto inteiro dentro da papila gustativa, bem como suas relações com células transdutoras de sabor.
A preservação e a coloração de vários desses elementos em uma única preparação ampliam as possibilidades de análise e refinam as medidas possíveis.
