Estudos de imunização materna e transferência de anticorpos são inestimáveis por inúmeras razões, pois esta é a rota inicial de transferência de imunidade e posterior proteção contra patógenos e doenças em recém-nascidos e bebês. Devido às semelhanças na placenta e transferência de anticorpos com humanos, os coelhos são um excelente modelo de imunização materna. Neste artigo em vídeo demonstramos técnicas que nosso laboratório tem utilizado em estudos de imunização materna em Coelhos Brancos da Nova Zelândia, incluindo imunização intranasal e coleta de leite.
Primeiro descreveremos um exemplo de cronograma e uma série de eventos para um estudo de imunização materna mucosa em Coelhos Brancos da Nova Zelândia. Coelhos fêmeas são imunizados pela via intranasal, como demonstrado neste vídeo. Dependendo do estudo, a vacina pode exigir um impulso ou pode precisar ser dada através de uma rota adicional, como a imunização intramuscular.
Embora não representado, o sangue deve ser coletado antes da imunização inicial para medições de linha de base, e durante todo o restante do estudo em intervalos regulares. O sangue é facilmente obtido pela artéria do ouvido central com sedação leve e um agente analgésico tópico. A presença de níveis de IgG específicos de antígeno pode ser medida nestas amostras.
Coelhos são então criados. Preferimos comprar criadores comprovados de fornecedores para usar para garantir uma maior taxa de gravidez para esses estudos. Dependendo do cronograma de imunização, os coelhos podem receber imunizações adicionais durante a gravidez.
IgG específico de antígeno é transferido transplacently para os kits. Com aproximadamente 30 a 32 dias de gravidez pós-reprodução vai acender. Recomendamos limitar o manuseio dos kits nos primeiros dias para minimizar a rejeição dos faz.
Amostras de sangue podem ser coletadas dos kits para avaliar os níveis de IgG específicos de antígeno que foram transferidos transplacently. O sangue pode ser coletado de um pequeno número de kits na hora do nascimento ou perto do momento do nascimento para avaliar os níveis de anticorpos específicos do antígeno precoce. Além de uma grande variedade de nutrientes, os kits recebem IgA específico de antígeno do xixi enquanto amamentam.
Os kits são tipicamente desmamados com quatro a oito semanas de idade. Antes do desmamar o leite pode ser facilmente coletado de lactantes faz como demonstrado neste vídeo. As amostras de leite coletadas são então processadas para a detecção de IgA específico de antígeno.
Dependendo do estudo, vacinas e um impulso podem ser administrados nos kits e amostras de sangue em série podem ser coletados dos kits muito cedo usando a veia lateral safena. Agora demonstraremos a imunização intranasal e a coleta de leite em Coelhos Brancos da Nova Zelândia.Protocolo. Todos os procedimentos foram aprovados e realizados de acordo com as políticas do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade duke.
Imunização Intranasal. Materiais Necessários:Acepromazina, seringa e agulha, lubrificante oftálmico, Isoflurane, cone de nariz, pipeta e pipeta, vacina mucosa. Prepare a solução de imunização antes do manuseio de animais.
Coelhos são sedados com acepromazina um miligrama por quilograma intramuscularmente, e anestesiados com Isoflurane usando um cone de nariz. Uma vez totalmente anestesiado como avaliado pelo reflexo das pálpebras, um lubrificante oftálmico é adicionado a cada olho para evitar a secagem dos olhos e posterior ulceração córnea. Uma vez que o membro do laboratório esteja pronto para administrar a vacina e o coelho esteja em um plano adequado de anestesia, desligue o isoflurane e o oxigênio e remova o cone do nariz.
Coloque o coelho em recumbência dorsal e apoie o pescoço e a cabeça em um ângulo aproximado de 45 graus que permite fácil acesso e visualização de ambos os alars pelo membro do laboratório que administra a vacina. Carregue a pipeta com no máximo 100 microlitadores da solução vacinal e administre rapidamente a solução em uma narina e repita o procedimento para a segunda narina. A pipeta deve ser mantida em um ângulo aproximado de 45 graus.
Ângulo para o aspecto medial da passagem nasal. O objetivo da imunização é a solução para entrar em contato com as membranas mucosas das nares. Assim, a ponta não deve ser colocada dentro das nares, pois isso pode resultar em abrasão ou irritação dos tecidos mucosas e potencialmente influenciar a imunogenicidade da vacina administrada nasally.
A vacina deve ser administrada rapidamente e feita da mesma forma na outra narina. Após a administração em ambas as passagens nasais, o coelho é mantido em recumbência dorsal por 30 segundos para minimizar o vazamento da solução vacinal. O laboratório normalmente não administrará mais de 100 microliters por narina de cada vez.
Se um volume maior for administrado com um volume total máximo de 500 microliters, a vacina pode ser dada em 100 alíquotas de microliter com um período de descanso de 30 segundos entre as imunizações. E administrações adicionais de vacina repetidas com 30 segundos de descanso entre cada administração até que o volume total da vacina seja entregue. Após a imunização, coloque o coelho no ventrum para recuperação e monitore de perto o animal até que ele seja capaz de manter a recumbência severa.
Em alguns casos, a formulação da vacina pode não ser completamente entregue na cavidade nasal e uma parte da formulação da vacina pode permanecer na porção externa das nares. Neste caso, por não estar claro do volume exato da vacina que foi devidamente entregue na cavidade nasal, não recomendo a reaplicação de material vacinal adicional, pois isso adicionaria uma variável indefinida ao experimento. É importante utilizar uma técnica de entrega de vacinas que proporcione a entrega completa e consistente da formulação da vacina aos nares.
Coleta de leite. Materiais necessários:Acepromazina, seringas e agulhas, cotonete de álcool, gaze, lubrificante oftálmico, Isoflurane, cone de nariz, ocitocina e um frasco de coleta. Coelhos são sedados com acepromazina um miligrama por quilograma intramuscularmente, e anestesiados com Isoflurane usando um cone de nariz.
Uma vez totalmente anestesiado como avaliado pelo reflexo das pálpebras, um lubrificante oftálmico é aplicado em cada olho para evitar a secagem dos olhos e posterior ulceração córnea. Limpe a pele sobre a veia marginal do ouvido com o cotonete de álcool. Usando uma seringa de um mil e uma agulha de calibre 25, administre aproximadamente uma a duas unidades internacionais de ocitocina por via intravenosa pela veia marginal do ouvido para induzir o leite solto.
Devido ao relaxamento muscular suave, é comum o coelho urinar ou defecar após a administração da ocitocina. Após a administração da ocitocina, aplique pressão no local da injeção com um pedaço de gaze para fornecer hemostasia. Enquanto mantém a máscara de anestesia ou cone de nariz sobre o nariz do coelho, apoie o coelho em seus aposentos traseiros.
Como nota lateral, a coleta de leite também pode ser realizada com o animal em recumbência lateral, mas o laboratório descobre que a coleta é mais fácil quando o coelho é apoiado em sua garupa com um assistente segurando o coelho ereto com a máscara de anestesia. Abra o tubo estéril para preparar para a coleta de leite e localizar o tecido mamário e as associadas. Coelhos normalmente têm de quatro a cinco pares de glândulas mamárias.
As são tipicamente cercadas por peles molhadas da enfermagem recente e o tecido mamário é facilmente palpável quando cheio de leite. Segure-se no tecido mamário associado com a entre o polegar e o indicador e aplique uma pressão suave de massagem no tecido glandular na direção da. Coloque o tubo de coleta sobre a para coletar o leite expresso.
Às vezes pode levar vários minutos para que a ocitocina seja eficaz, e a produção de leite parece variar entre as glândulas mamárias. Se a expressão do leite não for bem sucedida, espere vários minutos ou gire em torno de uma glândula mamária adicional. O leite de todas as pode ser coletado na mesma vil.
Normalmente, vários mililitros de leite podem ser facilmente coletados de um doe lactante. Depois que o volume desejado de leite tiver sido coletado, desligue o Isoflurane e o oxigênio e remova o cone do nariz do coelho, e permita que o coelho se recupere enquanto é monitorado de perto até que o animal seja capaz de manter a recumência severa. Resultados representativos.
Figura um. Para estudos maternos, determinar a gravidez o mais cedo possível é útil para confirmar que a doe não precisa ser re-criada. As opções para detecção da gravidez incluem palpação, ultrassom, radiografias, ganho de peso e técnicas moleculares, como medidas de fatores de crescimento de insulina e progesterona.
Níveis adequados de progesterona são necessários para a manutenção da gravidez em coelhos. Portanto, vários estudos também avaliaram os níveis de progesterona em coelhos gestantes e demonstraram níveis elevados em relação aos coelhos não gestantes, particularmente durante a organogênese em torno da gestação média. Como mostrado na figura um, níveis elevados de progesterona podem ser detectados em coelhos grávidas em comparação com coelhos não gestantes, mesmo após acasalamentos por um dólar foram confirmados para todos.
Os níveis de progesterona séum foram medidos usando um ensaio automatizado de quimiominascente. Figura dois. IgG específico de antígeno que foi transferido transplacentalmente durante a gestação pode ser medido no soro dos kits por Elisa.
O sangue pode ser coletado de um pequeno número de kits na hora do nascimento ou perto do momento do nascimento para avaliar os níveis de anticorpos específicos do antígeno precoce. A coleta de sangue serial é tecnicamente muito mais fácil à medida que os kits envelhecem e aumentam de tamanho. Como descrito na Figura Dois, os níveis de soro de IgG específico de antígeno nos kits podem ser medidos e comparados aos níveis maternos.
Os níveis de IgG transferidos maternamente são mais elevados ao nascer e diminuem ao longo do tempo. Figura Três. O leite de coelho pode ser coletado como mostrado neste vídeo, e processado para medir os níveis totais e de anticorpos específicos de antígeno por Elisa.
Como mostrado nesta figura, o IgA compõe uma parcela significativa do total de anticorpos dentro do leite materno que estão disponíveis para transferência passiva para os kits. Ambos os níveis de IgA e IgG são consideravelmente mais altos do que o IgM.Summary. Este artigo em vídeo descreve e demonstra a administração de vacinas intranasais e a coleta de leite de coelhos lactadores como forma de avaliar a imunidade mucosa em um modelo translacionalmente apropriado de imunização materna.
Retratado é uma imagem resumida para um desenho típico de estudo de imunização intranasal materna que incorpora as imunizações, reprodução, kindling, lactação e transferência de anticorpos.
