Os anticorpos monoclonais derivados são usados principalmente em reagentes imunes terapêuticos diagnósticos, destacando a necessidade de produzir anticorpos estáveis e confiáveis em produção limitada preparados. Os métodos aqui descritos provaram que a produção de anticorpos recombinantes pode aumentar a eficiência da produção de anticorpos monoclonais e minimizar os custos associados à mão de obra e ao tempo. Os métodos são usados para desenvolver conjugados de drogas à base de aminoácidos e anticorpos à base de anticorpos e outros produtos terapêuticos, o que ajuda a esclarecer o papel da PNA na prevenção e tratamento de infecções bacterianas e virais.
Quem demonstrará o procedimento será Yan Li, aluno de pós-graduação do meu laboratório. Para começar, injete intraperitonealmente 100 microgramas de proteína APN nos camundongos fêmeas adultas selecionados para um reforço final de antígeno. Após três dias de injeção, colete os baços de camundongos e lave com DMEM duas vezes para remover o sangue e as células de gordura.
Filtrar a suspensão de células do baço usando uma grade de cobre de 200 malhas para remover restos de tecido e colher células do baço usando centrifugação para remover a membrana do baço. Semeando as células do mieloma SP20 de camundongos em um frasco de 25 centímetros quadrados contendo cinco mililitros de DMEM suplementado com 6% de soro fetal bovino e cultivar as células a 37 graus Celsius e 6% de atmosfera de dióxido de carbono para manter a viabilidade celular. Após cinco a seis dias de cultura, as células devem atingir 80 a 90% de confluência após a ressuscitação e aparecer redondas, brilhantes e claras ao microscópio.
Um dia antes da hibridização, coletar macrófagos das cavidades peritoneais dos camundongos. Sementes de macrófagos peritoneais a uma densidade de 0,1 a 0,2 vezes 10 a quinto por mililitro em placas de 96 poços, cada uma contendo 100 microlitros de meio HAT e incubá-los durante a noite. Para hibridização, aspirar suavemente as células SP20 com uma pipeta de 8 a 10 frascos e suspendê-las em 10 mililitros de meio DMEM sem soro.
Lave as células com DMEM fresco e centrifugue-as duas vezes, depois ressuspenda-as em 10 mililitros de DMEM. Misture as células quantificadas do baço com as células SB20 na proporção de 10:1 e transfira-as para tubos de 50 mililitros. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante e colete os pellets no fundo dos tubos.
Bata no tubo para soltar os pellets antes da hibridização. Usando um conta-gotas, adicione um mililitro de polietilenoglicol 1500 pré-aquecido a 37 graus Celsius gota a gota ao pellet de célula solto durante 45 segundos enquanto gira suavemente o fundo do tubo. Em seguida, adicione lentamente um mililitro de DMEM pré-aquecido a 37 graus Celsius à mistura por 90 segundos, seguido por outros 30 mililitros de DMEM fresco e coloque o tubo de fusão em banho-maria de 37 graus Celsius por 30 minutos.
Após a incubação, colher as células. Ressuspender o meio HAT e cultura em placa de 96 poços inoculada com macrófagos peritoneais. Após cinco dias, adicione 100 microlitros de meio HAT fresco a cada poço.
E novamente após cinco dias de incubação, substitua o meio por meio HAT. Utilizar uma placa de microtitulação revestida com cinco microgramas por mililitro de proteína APN diluída em PBS 0,05 molar para analisar anticorpos monoclonais no sobrenadante de hibridomas usando ensaio de ELISA. Cultivar o pET28a mais anticorpos recombinantes aminopeptidase NBL21 bactérias transformadas na presença de 0,4 milimolar beta-d-1-thiogalactopyranoside em um agitador orbital a 37 graus Celsius por 10 horas.
Semear 100 microlitros 0,5 vezes 10 até a quinta célula do ovário de hamster chinês por poço em uma placa de 96 poços para incubação a 37 graus Celsius e uma atmosfera de dióxido de carbono de 6% por 18 a 24 horas. Quando as células atingirem 80 a 90% de confluência, diluir os anticorpos recombinantes pIRES2-zs Green one aminopeptidase e plasmídeo com Opti-MEM para uma concentração final de 0,1 microgramas por microlitro. Após cinco minutos, misturar os 50 microlitros de anticorpos recombinantes anti-aminopeptidases e plasmídeos pIRES2-zs Green diluídos com um microlitro de Lipofectamina 2000 e 49 microlitros de Opti-MEM.
Após 20 minutos de incubação, adicione 100 microlitros da mistura a cada poço de uma placa de 96 poços contendo células CHO. De quatro a seis horas após a transfecção, substituir o meio por DMEM F12 suplementado com SFB a 10%. Após 48 horas de incubação, adicione 400 microgramas por microlitro G418 a cada poço para selecionar as células transfectadas de forma estável.
Após 10 dias de seleção usando meio DMEM F12 suplementado com 10% FBS e 400 microgramas por microlitro G418, classificar as células com classificação celular ativada por fluorescência. Diluir serialmente as células positivas colhidas. Semeá-los a uma média de 0,5 a 2 células por poço em uma placa de 96 poços e cultivar em 37 graus Celsius, incubadora de dióxido de carbono a 6%.
Na análise microscópica representativa, todas as células do hibridoma apareceram redondas, brilhantes e claras. Os anticorpos monoclonais purificados possuindo cadeias pesadas de 50 kilodalton e leves de 25 quilodalton foram confirmados por SDS-PAGE e foram encontrados na ascite purificada. Os títulos desses anticorpos monoclonais anti-APN em sobrenadantes de cultura e ascite são mostrados aqui.
A isotipagem de anticorpos monoclonais em camundongos revelou que anticorpos derivados dos clones 5B31, 5B36, 3C48, 5C51 e 6C56 possuíam subclasses de imunoglobulina G2B, enquanto APN 2A20 era um anticorpo tipo kappa da imunoglobulina G2A e o anticorpo monoclonal APN 3FD9, 3F10 e 10F3 pertenciam às cadeias leves kappa processadas do tipo M e da imunoglobulina M. A maioria desses anticorpos monoclonais mostrou valores AV de mais de 50%, indicando que eles visaram diferentes epítopos na PNA, enquanto o anticorpo APN 5C51 reconheceu epítopos antigênicos como aqueles reconhecidos pelos anticorpos monoclonais APN 3C48, 5B31 e 6C56. O gene amplificado APN 5B36 VHVL foi ligado a um vetor pET28a positivo ou pIRES2-zs Green one para construir os plasmídeos de expressão recombinante pET28a positivo para RABS APN e pIRES2-zs Green one RABS APN, respectivamente.
Os anticorpos expressos tanto pelo pET28a mais anticorpos recombinantes aminopeptidase NBL21 quanto pelos anticorpos recombinantes pIRES2-zs Green one aminopeptidase NCHO foram purificados e analisados por ELISA e RIFI. No entanto, apenas o anticorpo expresso no sobrenadante de pIRES2-zs Green um anticorpos recombinantes aminopeptidase células NCHO reconhecem a proteína APN. A ligação dos anticorpos monoclonais APN 5B36 às proteínas APN atingiu um equilíbrio mais precoce do que os anticorpos recombinantes.
A purificação dos anticorpos monoclonais no sobrenadante usando a proteína A agarose é melhor do que usando precipitação de sulfato de amônia saturada.
