Производные моноклональные антитела в основном используются в диагностических терапевтических иммунных реагентах, что подчеркивает необходимость получения стабильных и надежных антител в ограниченном производстве. Описанные здесь методы доказали, что производство рекомбинантных антител может повысить эффективность производства моноклональных антител и минимизировать трудозатраты и время. Методы используются для разработки конъюгатов лекарственных препаратов на основе аминопептидазы и антител на основе антител и других терапевтических продуктов, что помогает прояснить роль APN в профилактике и лечении бактериальных и вирусных инфекций.
Продемонстрировать процедуру будет Ян Ли, аспирант моей лаборатории. Для начала внутрибрюшинно вводят 100 микрограммов белка APN выбранным взрослым самкам мышей для окончательного повышения антигена. После трех дней инъекции соберите селезенку у мышей и дважды промойте DMEM, чтобы удалить кровь и жировые клетки.
Отфильтруйте суспензию клеток селезенки с помощью медной сетки 200 меш для удаления тканевого мусора и соберите клетки селезенки с помощью центрифугирования для удаления мембраны селезенки. Посейте мышиные клетки миеломы SP20 в колбу площадью 25 квадратных сантиметров, содержащую пять миллилитров DMEM с добавлением 6% эмбриональной бычьей сыворотки, и культивируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 6% атмосферы углекислого газа для поддержания жизнеспособности клеток. После пяти-шести дней культивирования клетки должны достичь 80-90% слияния после реанимации и казаться круглыми, яркими и четкими под микроскопом.
За сутки до гибридизации собирают макрофаги из брюшных полостей мышей. Засевают перитонеальные макрофаги плотностью от 0,1 до 0,2 раза от 10 до пятой на миллилитр в 96-луночных планшетах, каждая из которых содержит 100 микролитров среды HAT, и инкубируют их в течение ночи. Для гибридизации аккуратно аспирируют клетки SP20 пипеткой от 8 до 10 флаконов и суспендируют их в 10 миллилитрах безсывороточной среды DMEM.
Промойте клетки свежим DMEM и дважды центрифугируете, затем ресуспендируйте их в 10 миллилитрах DMEM. Смешайте количественные клетки селезенки с клетками SB20 в соотношении 10:1 и перенесите их в 50-миллилитровые пробирки. После центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость и соберите гранулы на дне пробирок.
Постучите по трубке, чтобы ослабить гранулы перед гибридизацией. С помощью пипетки добавьте один миллилитр полиэтиленгликоля 1500, предварительно нагретого до 37 градусов Цельсия, по каплям в разрыхленную гранулу ячейки в течение 45 секунд, осторожно вращая дно трубки. Затем медленно добавьте один миллилитр DMEM, предварительно нагретого до 37 градусов Цельсия, в смесь в течение 90 секунд, а затем еще 30 миллилитров свежего DMEM и поместите термоядерную трубку в водяную баню с температурой 37 градусов Цельсия на 30 минут.
После инкубации заготавливают ячейки. Ресуспендируют среду HAT и культуру в 96-луночной пластине, инокулированной перитонеальными макрофагами. Через пять дней добавьте в каждую лунку по 100 микролитров свежей среды HAT.
И снова после пяти дней инкубации замените среду на среду HAT. Используйте микротитровальную пластину, покрытую пятью микрограммами на миллилитр белка APN, разбавленного в 0,05 молярного PBS, для анализа моноклональных антител в супернатанте гибридом с использованием анализа ИФА. Выращивайте pET28a плюс рекомбинантные антитела аминопептидазы NBL21, трансформированные бактерии в присутствии 0,4 миллимолярного бета-d-1-тиогалактопиранозида в орбитальном шейкере при 37 градусах Цельсия в течение 10 часов.
Засейте 100 микролитров 0,5 раза по 10 до пятого ячеек яичников китайского хомяка в лунку в 96-луночную тарелку для инкубации при 37 градусах Цельсия и атмосфере углекислого газа 6% в течение 18-24 часов. Когда клетки достигнут слияния от 80 до 90%, разбавьте рекомбинантные антитела pIRES2-zs Green с помощью Opti-MEM до конечной концентрации 0,1 мкг на микролитр. Через пять минут смешайте 50 микролитров разбавленных рекомбинантных антител pIRES2-zs Green с аминопептидазами и плазмидой с одним микролитром Lipofectamine 2000 и 49 микролитрами Opti-MEM.
После 20 минут инкубации добавьте по 100 микролитров смеси в каждую лунку 96-луночной пластины, содержащей клетки СНО. Через четыре-шесть часов после трансфекции замените среду на DMEM F12 с добавлением 10% FBS. После 48 часов инкубации добавьте 400 микрограммов на микролитр G418 в каждую лунку, чтобы выбрать стабильно трансфицированные клетки.
После 10 дней отбора с использованием среды DMEM F12 с добавлением 10% FBS и 400 мкг на микролитр G418 отсортируйте клетки с помощью сортировки клеток, активированной флуоресценцией. Последовательно разводят собранные положительные клетки. Высевают их в среднем по 0,5-2 ячейки на лунку в 96-луночный планшет и культивируют в инкубаторе с температурой 37 градусов по Цельсию и 6% углекислым газом.
При репрезентативном микроскопическом анализе все клетки гибридом оказались круглыми, яркими и четкими. Очищенные моноклональные антитела, обладающие тяжелыми цепями 50 килодальтон и легкими цепями 25 килодальтон, были подтверждены SDS-PAGE и обнаружены в очищенном асците. Здесь показаны титры этих моноклональных антител против APN в культуральных супернатантах и асците.
Изотипирование моноклональных антител мыши показало, что антитела, полученные из клонов 5B31, 5B36, 3C48, 5C51 и 6C56, обладают подклассами иммуноглобулина G2B, в то время как APN 2A20 представляет собой антитело типа каппа иммуноглобулина G2A, а моноклональное антитело APN 3FD9, 3F10 и 10F3 принадлежит к типу иммуноглобулина М и обработанным легким цепям каппа. Большинство из этих моноклональных антител показали значения AV более 50%, что указывает на то, что они были нацелены на различные эпитопы в APN, в то время как антитело APN 5C51 распознавало антигенные эпитопы, подобные тем, которые распознаются моноклональными антителами APN 3C48, 5B31 и 6C56. Амплифицированный ген APN 5B36 VHVL лигировали в pET28a положительный или pIRES2-zs Green один вектор для построения плазмид рекомбинантной экспрессии pET28a положительного RABS APN и pIRES2-zs Green одного RABS APN соответственно.
Антитела, экспрессируемые клетками NCHO как pET28a, так и рекомбинантными антителами аминопептидазы NBL21 и рекомбинантными антителами ncho pIRES2-zs Green, были очищены и проанализированы с использованием анализов ИФА и ИФА. Однако только антитело, экспрессируемое в надосадочной жидкости клеток pIRES2-zs Green One рекомбинантных антител аминопептидазы NCHO, распознают белок APN. Связывание моноклональных антител APN 5B36 с белками APN достигало равновесия раньше, чем рекомбинантных антител.
Очистка моноклональных антител в надосадочной жидкости с помощью агарозы белка А лучше, чем с использованием осаждения насыщенного сульфата аммиака.
