유도된 단일클론 항체는 주로 진단 치료용 면역 시약에 사용되며, 제조된 제한된 생산에서 안정적이고 신뢰할 수 있는 항체를 생산할 필요성을 강조한다. 여기에 설명된 방법은 재조합 항체 생산이 단클론 항체 생산 효율을 높이고 노동 및 시간 관련 비용을 최소화할 수 있음을 입증했습니다. 이 방법은 박테리아 및 바이러스 감염의 예방 및 치료에서 APN의 역할을 명확히 하는 데 도움이 되는 아미노펩티다아제 및 항체 기반 항체 약물 접합체 및 기타 치료 제품을 개발하는 데 사용됩니다.
이 절차를 시연하는 것은 내 연구실의 대학원생 인 Yan Li가 될 것입니다. 먼저, 최종 항원 부스트를 위해 선택된 성인 암컷 마우스에 100마이크로그램의 APN 단백질을 복강 주사합니다. 주사 3일 후 생쥐의 비장을 채취하여 DMEM으로 2회 세척하여 혈액과 지방세포를 제거한다.
비장세포 현탁액을 200메쉬 구리 그리드를 이용하여 여과하여 조직 파편을 제거하고, 원심분리를 이용하여 비장세포를 채취하여 비장막을 제거하였다. 6% 소 태아 혈청이 보충된 5밀리리터의 DMEM이 들어 있는 25제곱센티미터 플라스크에 마우스 SP20 골수종 세포를 시드하고 세포 생존율을 유지하기 위해 섭씨 37도 및 6% 이산화탄소 분위기에서 세포를 배양합니다. 배양 5-6일 후, 세포는 소생술 후 80-90%의 합류에 도달해야 하며 현미경으로 둥글고 밝고 투명하게 보입니다.
혼성화 하루 전, 생쥐의 복강에서 대 식세포를 수집하십시오. 복막 대식세포를 각각 100 마이크로리터의 HAT 배지를 함유하는 96-웰 플레이트에서 밀리리터당 0.1 내지 0.2배의 밀도로 시딩하고, 이들을 밤새 배양한다. 하이브리드화를 위해 8-10병의 피펫으로 SP20 세포를 부드럽게 흡인하고 10밀리리터의 무혈청 DMEM 배지에 현탁합니다.
세포를 새로운 DMEM으로 세척하고 두 번 원심분리한 다음 10밀리리터의 DMEM에 다시 현탁합니다. 정량화 된 비장 세포를 SB20 세포와 10 : 1의 비율로 혼합하여 50 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 원심분리 후, 상층액을 버리고 튜브 바닥에 펠릿을 수집합니다.
하이브리드화하기 전에 튜브를 두드려 펠릿을 풉니다. 스포이드를 사용하여 섭씨 37도로 예열된 폴리에틸렌 글리콜 1500 1밀리리터를 튜브 바닥을 부드럽게 회전시키면서 느슨해진 셀 펠릿에 45초에 걸쳐 떨어뜨립니다. 그런 다음 섭씨 37도로 예열된 DMEM 1밀리리터를 혼합물에 90초 동안 천천히 첨가한 다음, 새로운 DMEM 30밀리리터를 추가로 첨가하고 융합 튜브를 섭씨 37도의 수조에 30분 동안 넣습니다.
배양 후 세포를 수확합니다. HAT 배지를 재현탁하고 복막 대식세포가 접종된 96웰 플레이트에서 배양합니다. 5일 후, 100 마이크로리터의 신선한 HAT 배지를 각 웰에 첨가한다.
그리고 다시 5일간의 배양 후, 배지를 HAT 배지로 교체한다. 0.05몰 PBS로 희석된 밀리리터당 5마이크로그램 APN 단백질로 코팅된 마이크로타이터 플레이트를 사용하여 ELISA 분석을 사용하여 하이브리도마 상청액의 단클론 항체를 분석합니다. 섭씨 37도의 궤도 쉐이커에서 pET28a 플러스 재조합 항체 아미노펩티다제 NBL21 형질전환된 박테리아를 0.4밀리몰 베타-d-1-티오갈락토피라노시드의 존재 하에 성장시킵니다.
웰 당 100 마이크로리터 10 내지 5번째 차이니즈 햄스터 난소 세포를 섭씨 37도 및 6% 이산화탄소 분위기에서 18 내지 24시간 동안 배양하기 위해 96-웰 플레이트에 시드한다. 세포가 80 내지 90% 합류에 도달하면, pIRES2-zs Green 1 재조합 항체 아미노펩티다아제 및 플라스미드를 Opti-MEM으로 마이크로리터당 0.1 마이크로그램의 최종 농도로 희석한다. 5분 후, 50 마이크로리터의 희석된 pIRES2-zs 그린 1 재조합 항체 아미노펩티다아제 및 플라스미드를 1 마이크로리터의 리포펙타민 2000 및 49 마이크로리터의 옵티-MEM과 혼합한다.
20분 배양 후, 100 마이크로리터의 혼합물을 CHO 세포를 함유하는 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 형질감염 후 4-6시간 후, 10%FBS가 보충된 DMEM F12로 배지를 교체한다. 48 시간의 배양 후, 각 웰에 마이크로 리터 당 400 마이크로 그램 G418을 첨가하여 안정적으로 형질 감염된 세포를 선택한다.
10% FBS 및 마이크로리터당 400마이크로그램 G418이 보충된 DMEM F12 배지를 사용하여 10일 동안 선택한 후 형광 활성화 세포 분류로 세포를 분류합니다. 수확 된 양성 세포를 연속적으로 희석한다. 96웰 플레이트에서 웰당 평균 0.5-2개의 세포로 시드하고 섭씨 37도, 6% 이산화탄소 인큐베이터에서 배양합니다.
대표적인 현미경 분석에서, 모든 하이브리도마 세포는 둥글고, 밝고, 투명하게 나타났다. 무거운 50 킬로달톤 및 가벼운 25 킬로달톤 사슬을 보유하는 정제된 단일클론 항체를 SDS-PAGE에 의해 확인하였고, 정제된 복수에서 발견하였다. 배양 상청액 및 복수에서 이러한 항-APN 단일클론 항체의 역가가 여기에 나와 있습니다.
마우스 단클론 항체 이소타이핑은 클론 5B31, 5B36, 3C48, 5C51 및 6C56으로부터 유래된 항체가 면역글로불린 G2B 서브클래스를 보유하는 반면, APN 2A20은 면역글로불린 G2A 카파 유형 항체 및 모노클로날 항체 APN 3FD9, 3F10 및 10F3은 면역글로불린 M 유형 및 가공된 카파 경쇄에 속하는 것으로 나타났다. 이러한 단클론 항체의 대부분은 APN에서 서로 다른 에피토프를 표적으로 삼았음을 나타내는 50% 이상의 AV 값을 보였으며 APN 5C51 항체는 APN 3C48, 5B31 및 6C56 단클론 항체에서 인식하는 것과 같은 항원 에피토프를 인식했습니다. 증폭된 APN 5B36 VHVL 유전자를 pET28a 양성 또는 pIRES2-zs Green one 벡터에 라이게이션하여 재조합 발현 플라스미드 pET28a 양성 RABS APN 및 pIRES2-zs Green one RABS APN을 각각 작제하였다.
재조합 항체 아미노펩티다제 NBL21 및 pIRES2-zs 그린 둘 다에 의해 발현된 항체를 정제하고, 재조합 항체인 아미노펩티다아제 NCHO 세포를 정제하고, ELISA 및 IFA 분석을 사용하여 분석하였다. 그러나 pIRES2-zs Green의 상층액에서 발현된 항체만이 재조합 항체인 아미노펩티다아제 NCHO 세포는 APN 단백질을 인식한다. APN 단백질에 대한 APN 5B36 단일클론 항체의 결합은 재조합 항체보다 일찍 평형에 도달했습니다.
단백질 A 아가로스를 사용하여 상청액에서 모노클로날 항체를 정제하는 것은 포화 암모니아 설페이트 침전을 사용하는 것보다 낫다.
