Abgeleitete monoklonale Antikörper werden hauptsächlich in diagnostischen therapeutischen Immunreagenzien verwendet, was die Notwendigkeit unterstreicht, stabile und zuverlässige Antikörper in begrenzter Produktion herzustellen. Die hier beschriebenen Methoden zeigten, dass die Produktion rekombinanter Antikörper die Effizienz der Produktion von monoklonalen Antikörpern steigern und die damit verbundenen Arbeits- und Zeitkosten minimieren kann. Die Methoden werden zur Entwicklung von Aminopeptidase- und Antikörper-basierten Antikörper-Wirkstoffkonjugaten und anderen therapeutischen Produkten verwendet, die zur Klärung der Rolle von APN bei der Prävention und Behandlung von bakteriellen und viralen Infektionen beitragen.
Yan Li, ein Doktorand aus meinem Labor, wird das Verfahren vorführen. Zu Beginn werden den ausgewählten erwachsenen weiblichen Mäusen intraperitoneal 100 Mikrogramm APN-Protein injiziert, um einen endgültigen Antigen-Boost zu erhalten. Nach dreitägiger Injektion die Milz von Mäusen entnehmen und zweimal mit DMEM waschen, um Blut- und Fettzellen zu entfernen.
Filtern Sie die Milzzellsuspension mit einem 200-Mesh-Kupfergitter, um Gewebetrümmer zu entfernen, und entnehmen Sie Milzzellen durch Zentrifugation, um die Milzmembran zu entfernen. Säen Sie die SP20-Myelomzellen der Maus in einen 25 Quadratzentimeter großen Kolben, der fünf Milliliter DMEM enthält, ergänzt mit 6 % fötalem Kälberserum, und kultivieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 6 % Kohlendioxidatmosphäre, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten. Nach fünf bis sechs Tagen Kultur sollten die Zellen nach der Reanimation eine Konfluenz von 80 bis 90 % erreichen und unter dem Mikroskop rund, hell und klar erscheinen.
Einen Tag vor der Hybridisierung sammeln Sie Makrophagen aus den Bauchhöhlen der Mäuse. Peritonealmakrophagen werden in einer Dichte von 0,1 bis 0,2 mal 10 bis fünf pro Milliliter in 96-Well-Platten mit jeweils 100 Mikrolitern HAT-Medium ausgesät und über Nacht inkubiert. Für die Hybridisierung werden SP20-Zellen vorsichtig mit einer Pipette von 8 bis 10 Flaschen abgesaugt und in 10 Millilitern serumfreiem DMEM-Medium suspendiert.
Waschen Sie die Zellen mit frischem DMEM und zentrifugieren Sie sie zweimal, dann resuspendieren Sie sie in 10 Milliliter DMEM. Mischen Sie die quantifizierten Milzzellen mit SB20-Zellen im Verhältnis 10:1 und überführen Sie sie in 50-Milliliter-Röhrchen. Entsorgen Sie nach dem Zentrifugieren den Überstand und sammeln Sie die Pellets am Boden der Röhrchen.
Klopfen Sie auf das Röhrchen, um die Pellets vor der Hybridisierung zu lösen. Geben Sie mit einer Pipette einen Milliliter auf 37 Grad Celsius vorgewärmtes Polyethylenglykol 1500 über 45 Sekunden tropfenweise in das gelöste Zellpellet, während Sie den Boden der Tube vorsichtig drehen. Geben Sie dann langsam einen Milliliter auf 37 Grad Celsius vorgewärmtes DMEM für 90 Sekunden in die Mischung, gefolgt von weiteren 30 Millilitern frischem DMEM und legen Sie das Fusionsröhrchen für 30 Minuten in ein 37 Grad Celsius warmes Wasserbad.
Nach der Inkubation werden die Zellen geerntet. Resuspendieren Sie das HAT-Medium und die Kultur in einer 96-Well-Platte, die mit Peritonealmakrophagen inokuliert wurde. Geben Sie nach fünf Tagen 100 Mikroliter frisches HAT-Medium in jede Vertiefung.
Ersetzen Sie das Medium nach fünf Tagen Inkubationszeit durch HAT-Medium. Verwenden Sie eine Mikrotiterplatte, die mit fünf Mikrogramm APN-Protein pro Milliliter beschichtet ist, das in 0,05 molaren PBS verdünnt ist, um monoklonale Antikörper im Hybridomüberstand mit einem ELISA-Assay zu analysieren. Züchten Sie die pET28a plus rekombinanten Antikörper Aminopeptidase NBL21 transformierten Bakterien in Gegenwart von 0,4 millimolaren beta-d-1-thiogalactopyranosid in einem orbitalen Shaker bei 37 Grad Celsius für 10 Stunden.
Samen: 100 Mikroliter 0,5 mal 10 bis zum fünften Eierstockzellen des chinesischen Hamsters pro Vertiefung in eine 96-Well-Platte, um sie 18 bis 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und einer 6%igen Kohlendioxidatmosphäre zu inkubieren. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 80 bis 90 % erreicht haben, werden die rekombinanten pIRES2-zs Green one-Antikörper Aminopeptidase und Plasmid mit Opti-MEM auf eine Endkonzentration von 0,1 Mikrogramm pro Mikroliter verdünnt. Mischen Sie nach fünf Minuten die 50 Mikroliter verdünnte rekombinante pIRES2-zs Green one-Antikörper, Aminopeptidasen und Plasmid mit einem Mikroliter Lipofectamin 2000 und 49 Mikrolitern Opti-MEM.
Nach 20-minütiger Inkubation geben Sie 100 Mikroliter der Mischung in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit CHO-Zellen. Vier bis sechs Stunden nach der Transfektion wird das Medium durch DMEM F12 ersetzt, das mit 10 % FBS ergänzt wird. Nach 48 Stunden Inkubation werden 400 Mikrogramm pro Mikroliter G418 in jede Vertiefung gegeben, um die stabil transfizierten Zellen auszuwählen.
Nach 10-tägiger Selektion mit DMEM F12-Medium, ergänzt mit 10 % FBS und 400 Mikrogramm pro Mikroliter G418, werden die Zellen mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung sortiert. Verdünnen Sie die geernteten positiven Zellen seriell. Säen Sie sie mit durchschnittlich 0,5 bis 2 Zellen pro Vertiefung in einer 96-Well-Platte aus und kultivieren Sie sie in einem Inkubator mit 6 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius.
In der repräsentativen mikroskopischen Analyse erschienen alle Hybridomzellen rund, hell und klar. Die gereinigten monoklonalen Antikörper mit schweren 50-Kilodalton- und leichten 25-Kilodalton-Ketten wurden durch SDS-PAGE bestätigt und in den gereinigten Aszites gefunden. Die Titer dieser monoklonalen Anti-APN-Antikörper in Kulturüberständen und Aszites sind hier dargestellt.
Die Isotypisierung von monoklonalen Antikörpern in der Maus zeigte, dass Antikörper, die von den Klonen 5B31, 5B36, 3C48, 5C51 und 6C56 stammten, Immunglobulin-G2B-Subklassen besaßen, während APN 2A20 ein Immunglobulin-Antikörper vom G2A-Kappa-Typ und der monoklonale Antikörper APN 3FD9, 3F10 und 10F3 zum Immunglobulin-M-Typ und prozessierte Kappa-Leichtketten gehörten. Die meisten dieser monoklonalen Antikörper wiesen AV-Werte von über 50% auf, was darauf hindeutet, dass sie auf verschiedene Epitope im APN abzielten, während der APN 5C51-Antikörper antigene Epitope erkannte, wie sie von den monoklonalen APN-Antikörpern 3C48, 5B31 und 6C56 erkannt wurden. Das amplifizierte APN 5B36 VHVL-Gen wurde in einen pET28a-positiven oder pIRES2-zs-Green-Vektor ligiert, um die rekombinanten Expressionsplasmide pET28a-positives RABS-APN bzw. pIRES2-zs-Green-RABS-APN zu konstruieren.
Die Antikörper, die sowohl von pET28a als auch von rekombinanten Antikörpern Aminopeptidase NBL21 und pIRES2-zs Green one rekombinanten Antikörpern exprimiert wurden, wurden aufgereinigt und mittels ELISA- und IFA-Assays analysiert. Allerdings erkennen nur die Antikörper, die im Überstand der pIRES2-zs Green exprimiert werden, rekombinante Antikörper, Aminopeptidase NCHO-Zellen, das APN-Protein. Die Bindung von monoklonalen APN 5B36-Antikörpern an APN-Proteine erreichte früher ein Gleichgewicht als rekombinante Antikörper.
Die Aufreinigung der monoklonalen Antikörper im Überstand mit Protein-A-Agarose ist besser als die Verwendung von gesättigter Ammoniumsulfat-Fällung.
