Gli anticorpi monoclonali derivati sono utilizzati principalmente nei reagenti immunitari terapeutici diagnostici, evidenziando la necessità di produrre anticorpi stabili e affidabili in produzione limitata preparata. I metodi qui descritti hanno dimostrato che la produzione di anticorpi ricombinanti potrebbe aumentare l'efficienza della produzione di anticorpi monoclonali e ridurre al minimo i costi associati al lavoro e al tempo. I metodi sono utilizzati per sviluppare coniugati di farmaci anticorpali a base di aminopeptidasi e anticorpi e altri prodotti terapeutici, che aiutano a chiarire il ruolo dell'APN nella prevenzione e nel trattamento delle infezioni batteriche e virali.
A dimostrare la procedura sarà Yan Li, uno studente post-laurea del mio laboratorio. Per iniziare, iniettare per via intraperitoneale 100 microgrammi di proteina APN nei topi femmina adulti selezionati per un aumento finale dell'antigene. Dopo tre giorni di iniezione, raccogliere la milza dai topi e lavare con DMEM due volte per rimuovere il sangue e le cellule adipose.
Filtrare la sospensione delle cellule della milza utilizzando una griglia di rame a 200 maglie per rimuovere i detriti tissutali e raccogliere le cellule della milza utilizzando la centrifugazione per rimuovere la membrana della milza. Seminare le cellule di mieloma SP20 del topo in un pallone di 25 centimetri quadrati contenente cinque millilitri di DMEM integrato con il 6% di siero bovino fetale e coltura delle cellule a 37 gradi Celsius e 6% di anidride carbonica in atmosfera per mantenere la vitalità cellulare. Dopo cinque-sei giorni di coltura, le cellule dovrebbero raggiungere l'80-90% di confluenza dopo la rianimazione e apparire rotonde, luminose e chiare al microscopio.
Un giorno prima dell'ibridazione, raccogliere i macrofagi dalle cavità peritoneali dei topi. Seminare macrofagi peritoneali ad una densità da 0,1 a 0,2 volte 10 al quinto per millilitro in piastre da 96 pozzetti, ciascuna contenente 100 microlitri di mezzo HAT e incubarli durante la notte. Per l'ibridazione, aspirare delicatamente le cellule SP20 con una pipetta da 8 a 10 flaconi e sospenderle in 10 millilitri di mezzo DMEM senza siero.
Lavare le cellule con DMEM fresco e centrifugarle due volte, quindi risospenderle in 10 millilitri di DMEM. Mescolare le cellule quantificate della milza con cellule SB20 in un rapporto di 10: 1 e trasferirle in tubi da 50 millilitri. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e raccogliere il pellet sul fondo dei tubi.
Picchiettare il tubo per allentare il pellet prima dell'ibridazione. Utilizzando un contagocce, aggiungere un millilitro di polietilenglicole 1500 preriscaldato a 37 gradi Celsius goccia nel senso della goccia al pellet cellulare allentato per 45 secondi mentre si ruota delicatamente il fondo del tubo. Quindi aggiungere lentamente un millilitro di DMEM preriscaldato a 37 gradi Celsius alla miscela per 90 secondi, seguito da altri 30 millilitri di DMEM fresco e posizionare il tubo di fusione in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 30 minuti.
Dopo l'incubazione, raccogliere le cellule. Risospendere il mezzo HAT e la coltura in una piastra a 96 pozzetti inoculata con macrofagi peritoneali. Dopo cinque giorni, aggiungere 100 microlitri di HAT fresco mezzo a ciascun pozzetto.
E di nuovo dopo cinque giorni di incubazione, sostituire il mezzo con HAT medium. Utilizzare una piastra di microtitolazione rivestita con cinque microgrammi per millilitro di proteina APN diluita in PBS molare 0,05 per analizzare gli anticorpi monoclonali nell'ibridoma surnatante utilizzando il test ELISA. Coltivare i batteri trasformati dagli anticorpi ricombinanti pET28a più aminopeptidasi NBL21 in presenza di 0,4 millimolari beta-d-1-tiogalattopiranoside in uno shaker orbitale a 37 gradi Celsius per 10 ore.
Seminare 100 microlitri 0,5 volte 10 al quinto criceto cinese cellule ovariche per pozzetto in una piastra da 96 pozzetti per l'incubazione a 37 gradi Celsius e un'atmosfera di anidride carbonica del 6% per 18-24 ore. Quando le cellule raggiungono l'80-90% di confluenza, diluire gli anticorpi ricombinanti pIRES2-zs Green uno aminopeptidasi e plasmide con Opti-MEM ad una concentrazione finale di 0,1 microgrammi per microlitro. Dopo cinque minuti, mescolare i 50 microlitri di pIRES2-zs Green diluito uno anticorpi ricombinanti aminopeptidasi e plasmide con un microlitro di Lipofectamine 2000 e 49 microlitri di Opti-MEM.
Dopo 20 minuti di incubazione, aggiungere 100 microlitri della miscela a ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti contenente cellule CHO. Da quattro a sei ore dopo la trasfezione, sostituire il mezzo con DMEM F12 integrato con 10% FBS. Dopo 48 ore di incubazione, aggiungere 400 microgrammi per microlitro G418 a ciascun pozzetto per selezionare le cellule stabilmente trasfettate.
Dopo 10 giorni di selezione utilizzando il terreno DMEM F12 integrato con 10% FBS e 400 microgrammi per microlitro G418, ordinare le cellule con la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza. Diluire in serie le cellule positive raccolte. Seminarli in media da 0,5 a 2 cellule per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti e coltura in 37 gradi Celsius, incubatore di anidride carbonica al 6%.
Nell'analisi microscopica rappresentativa, tutte le cellule degli ibridomi apparivano rotonde, luminose e chiare. Gli anticorpi monoclonali purificati contenenti catene pesanti da 50 kilodalton e catene leggere da 25 kilodalton sono stati confermati da SDS-PAGE e sono stati trovati nell'ascite purificata. I titoli di questi anticorpi monoclonali anti-APN nei supernatanti e nell'ascite di coltura sono mostrati qui.
L'isotipizzazione degli anticorpi monoclonali di topo ha rivelato che gli anticorpi derivati dai cloni 5B31, 5B36, 3C48, 5C51 e 6C56 possedevano sottoclassi di immunoglobuline G2B mentre APN 2A20 era un anticorpo di tipo kappa di immunoglobuline G2A e l'anticorpo monoclonale APN 3FD9, 3F10 e 10F3 apparteneva al tipo di immunoglobulina M e alle catene leggere kappa trasformate. La maggior parte di questi anticorpi monoclonali ha mostrato valori AV superiori al 50%, indicando che hanno preso di mira epitopi diversi nell'APN, mentre l'anticorpo APN 5C51 ha riconosciuto epitopi antigenici come quelli riconosciuti dagli anticorpi monoclonali APN 3C48, 5B31 e 6C56. Il gene VHVL APN 5B36 amplificato è stato legato in un vettore pET28a positivo o pIRES2-zs Green uno per costruire rispettivamente i plasmidi di espressione ricombinante pET28a positivo RABS APN e pIRES2-zs Green uno RABS APN.
Gli anticorpi espressi da pET28a più anticorpi ricombinanti aminopeptidasi NBL21 e pIRES2-zs Green uno anticorpi ricombinanti aminopeptidasi NCHO cellule NCHO sono stati purificati e analizzati utilizzando saggi ELISA e IFA. Tuttavia, solo l'anticorpo espresso nel surnatante di pIRES2-zs Green uno anticorpi ricombinanti aminopeptidasi NCHO cellule riconoscono la proteina APN. Il legame degli anticorpi monoclonali APN 5B36 alle proteine APN ha raggiunto un equilibrio prima degli anticorpi ricombinanti.
La purificazione degli anticorpi monoclonali nel surnatante usando la proteina A agarosio è migliore rispetto all'uso della precipitazione satura di solfato di ammoniaca.
