Elde edilen monoklonal antikorlar öncelikle tanısal terapötik immün reaktiflerde kullanılır ve hazırlanan sınırlı üretimde stabil ve güvenilir antikorların üretilmesi gerekliliğini vurgular. Burada açıklanan yöntemler, rekombinant antikor üretiminin monoklonal antikor üretim verimliliğini artırabileceğini ve işçilik ve zamanla ilişkili maliyetleri en aza indirebileceğini kanıtlamıştır. Yöntemler, bakteriyel ve viral enfeksiyonların önlenmesinde ve tedavisinde APN'nin rolünün açıklığa kavuşturulmasına yardımcı olan aminopeptidaz ve antikor bazlı antikor ilaç konjugatları ve diğer terapötik ürünleri geliştirmek için kullanılır.
Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Yan Li olacak. Başlamak için, son bir antijen artışı için seçilen yetişkin dişi farelere intraperitoneal olarak 100 mikrogram APN proteini enjekte edin. Üç günlük enjeksiyondan sonra, dalakları farelerden toplayın ve kan ve yağ hücrelerini çıkarmak için DMEM ile iki kez yıkayın.
Doku kalıntılarını gidermek için 200 örgülü bir bakır ızgara kullanarak dalak hücresi süspansiyonunu filtreleyin ve dalak zarını çıkarmak için santrifüjleme kullanarak dalak hücrelerini toplayın. Fare SP20 miyelom hücrelerini,% 6 fetal sığır serumu ile desteklenmiş beş mililitre DMEM içeren 25 santimetrekarelik bir şişeye yerleştirin ve hücre canlılığını korumak için hücreleri 37 santigrat derece ve% 6 karbondioksit atmosferinde kültürleyin. Beş ila altı günlük kültürden sonra, hücreler resüsitasyon sonrası% 80 ila% 90 birleşmeye ulaşmalı ve mikroskop altında yuvarlak, parlak ve net görünmelidir.
Hibridizasyondan bir gün önce, farelerin periton boşluklarından makrofajları toplayın. Periton makrofajlarını, her biri 100 mikrolitre HAT ortamı içeren 96 delikli plakalarda mililitre başına 0.1 ila 0.2 kat 10 ila beşinci yoğunlukta tohumlayın ve gece boyunca inkübe edin. Hibridizasyon için, SP20 hücrelerini 8 ila 10 şişe pipetle nazikçe aspire edin ve 10 mililitre serumsuz DMEM ortamında askıya alın.
Hücreleri taze DMEM ile yıkayın ve iki kez santrifüj edin, ardından 10 mililitre DMEM'de tekrar askıya alın. Kantifiye dalak hücrelerini SB20 hücreleri ile 10: 1 oranında karıştırın ve 50 mililitrelik tüplere aktarın. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı atın ve topakları tüplerin dibinde toplayın.
Hibridizasyondan önce topakları gevşetmek için tüpe dokunun. Bir damlalık kullanarak, tüpün tabanını yavaşça döndürürken, gevşemiş hücre peletine 45 saniye boyunca damla damla 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılmış bir mililitre polietilen glikol 1500 ekleyin. Daha sonra yavaşça 90 saniye boyunca karışıma önceden 37 santigrat dereceye ısıtılmış bir mililitre DMEM ekleyin, ardından 30 mililitre taze DMEM ekleyin ve füzyon tüpünü 30 dakika boyunca 37 santigrat derece su banyosuna yerleştirin.
Kuluçkadan sonra, hücreleri toplayın. HAT ortamını ve kültürünü, periton makrofajları ile aşılanmış 96 delikli bir plakada yeniden askıya alın. Beş gün sonra, her bir kuyucuğa 100 mikrolitre taze HAT ortamı ekleyin.
Ve yine beş günlük inkübasyondan sonra, ortamı HAT ortamı ile değiştirin. ELISA testi kullanarak hibridomas süpernatantındaki monoklonal antikorları analiz etmek için 0.05 molar PBS'de seyreltilmiş mililitre başına beş mikrogram APN proteini ile kaplanmış bir mikrotitre plakası kullanın. pET28a artı rekombinant antikorlar aminopeptidaz NBL21 dönüştürülmüş bakterileri, 10 saat boyunca 37 santigrat derecede bir orbital çalkalayıcıda 0.4 milimolar beta-d-1-tiogalaktopiranosid varlığında büyütün.
Kuyu başına 100 mikrolitre 0.5 kez 10 ila beşinci Çin hamster yumurtalık hücrelerini, 37 santigrat derecede inkübasyon için 96 delikli bir plakaya ve 18 ila 24 saat boyunca% 6'lık bir karbondioksit atmosferine tohumlayın. Hücreler% 80 ila% 90 birleşmeye ulaştığında, pIRES2-zs Green bir rekombinant antikorlar aminopeptidaz ve plazmidi Opti-MEM ile mikrolitre başına 0.1 mikrogramlık nihai bir konsantrasyona seyreltin. Beş dakika sonra, 50 mikrolitre seyreltilmiş pIRES2-zs Green bir rekombinant antikor, aminopeptidaz ve plazmidi bir mikrolitre Lipofectamine 2000 ve 49 mikrolitre Opti-MEM ile karıştırın.
20 dakikalık inkübasyondan sonra, CHO hücreleri içeren 96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 100 mikrolitre karışım ekleyin. Transfeksiyondan dört ila altı saat sonra, ortamı% 10 FBS ile desteklenmiş DMEM F12 ile değiştirin. 48 saatlik inkübasyondan sonra, kararlı bir şekilde transfekte edilmiş hücreleri seçmek için her bir kuyucuğa mikrolitre G418 başına 400 mikrogram ekleyin.
Mikrolitre G12 başına %10 FBS ve 400 mikrogram ile desteklenmiş 418 mikrogram kullanılarak 10 günlük seçimden sonra, floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama ile hücreleri sıralayın. Hasat edilen pozitif hücreleri seri olarak seyreltin. Onları 96 delikli bir plakada kuyu başına ortalama 0,5 ila 2 hücrede tohumlayın ve 37 santigrat derece,% 6 karbondioksit inkübatöründe kültüre alın.
Temsili mikroskobik analizde, tüm hibridom hücreleri yuvarlak, parlak ve net görünüyordu. Ağır 50 kilodalton ve hafif 25 kilodalton zincirlere sahip saflaştırılmış monoklonal antikorlar SDS-PAGE tarafından doğrulandı ve saflaştırılmış asitlerde bulundu. Bu anti-APN monoklonal antikorların kültür süpernatantları ve asitlerindeki titreleri burada gösterilmiştir.
Fare monoklonal antikor izotiplemesi, 5B31, 5B36, 3C48, 5C51 ve 6C56 klonlarından türetilen antikorların immünoglobulin G2B alt sınıflarına sahip olduğunu, APN 2A20'nin ise immünoglobulin G2A kappa tipi bir antikor ve monoklonal antikor APN 3FD9, 3F10 ve 10F3'ün immünoglobulin M tipine ait olduğunu ve kappa hafif zincirlerini işlediğini ortaya koymuştur. Bu monoklonal antikorların çoğu, APN'deki farklı epitopları hedef aldıklarını gösteren% 50'nin üzerinde AV değerleri gösterirken, APN 5C51 antikoru, APN 3C48, 5B31 ve 6C56 monoklonal antikorları tarafından tanınanlar gibi antijenik epitopları tanıdı. Güçlendirilmiş APN 5B36 VHVL geni, sırasıyla pET28a pozitif RABS APN ve pIRES2-zs Yeşil bir RABS APN rekombinant ekspresyon plazmidlerini oluşturmak için bir pET28a pozitif veya pIRES2-zs Yeşil bir vektöre bağlandı.
Hem pET28a artı rekombinant antikorlar aminopeptidaz NBL21 hem de pIRES2-zs Green bir rekombinant antikorlar aminopeptidaz NCHO hücreleri tarafından eksprese edilen antikorlar saflaştırıldı ve ELISA ve IFA testleri kullanılarak analiz edildi. Bununla birlikte, sadece pIRES2-zs Green bir rekombinant antikorları aminopeptidaz NCHO hücrelerinin süpernatantında eksprese edilen antikor APN proteinini tanır. APN 5B36 monoklonal antikorlarının APN proteinlerine bağlanması, rekombinant antikorlardan daha erken bir dengeye ulaşmıştır.
Süpernatanttaki monoklonal antikorların protein A agaroz kullanılarak saflaştırılması, doymuş amonyak sülfat çökeltmesi kullanmaktan daha iyidir.
