Nosso protocolo pode ser usado para visualizar a complexidade estrutural dos organoides, permitindo o mapeamento da identidade, sulfato e distribuição nessas estruturas 3D na resolução unicelular. Nosso protocolo rápido de três dias é totalmente otimizado para organoides de várias origens e usa uma preparação de amostra simples, que inclui uma etapa de limpeza óptica não tóxica e um método de montagem à base de silício. Embora nosso protocolo seja simples, alguns deles são etapas críticas, como o manuseio organizado, ou a preparação do slide, pode ser melhor explicado através de demonstração visual do que através de texto.
Para recuperar organoides de 100 a 500 micrômetros de diâmetro cultivados em extrato de membrana do porão em 24 placas de poço, lave cada solda a ser colhida com PBS sem interromper as matrizes 3D e coloque a placa no gelo. Adicione um mililitro de solução de recuperação gelada a cada poço e coloque a placa em um agitador horizontal a quatro graus Celsius por 30 a 60 minutos. Mergulhe uma pipeta mililitro em uma solução de 1%BSA em PBS e pipeta para cima e para baixo duas vezes para revestir cada ponta com BSA.
Em seguida, adicione cinco mililitros de 1%PBS BSA a um tubo de 15 mililitros por condição, e inverta o tubo duas a três vezes antes de descartar a solução, para revestir o interior do tubo. Para coletar os organoides, use uma ponta revestida para suspender suavemente o conteúdo do poço de cinco a dez vezes, e puxe todos os organoides de cada condição em um único tubo revestido de 15 mililitros. Enxágüe cada poço com um mililitro de BSA de 1%PBS A frio para garantir que todos os organoides tenham sido coletados e transfira as lavagens para os tubos apropriados.
Traga o volume final em cada tubo até 10 mililitros com PBS frio, e sedimente os organoides por centrifugação para obter uma paleta apertada sem uma camada visível de matriz 3D. Para corrigir os organoides, use uma ponta de pipeta de um mililitro revestida para suspender cuidadosamente cada pelota em um mililitro de gelo frio para formaldeído, e fixar a quatro graus Celsius por 45 minutos. Suspenda suavemente os organoides na metade do tempo de fixação.
Após 45 minutos, adicione 10 mililitros de PBS gelado mais interpolação 20 a cada tubo e misture suavemente por inversão, antes de colocar os tubos a quatro graus Celsius por 10 minutos. Para bloquear os organoides, no final da incubação, gire as amostras e suspenda as pelotas em pelo menos 200 microliters de tampão de lavagem organoide gelado por poço a ser banhado. Em seguida, transfira os organoides para poços individuais de uma placa de suspensão de 24 poços para uma incubação de 15 minutos a quatro graus Celsius.
Para imunolabelar adicione 200 microliters de tampão de lavagem organoide em um poço de referência vazio, e permita que os organoides se acomodem na parte inferior da placa. Quando os organoides se instalarem, incline a placa em um ângulo de 45 graus para permitir a remoção de todos, exceto os últimos 200 microliters de tampão de lavagem. Em seguida, adicione 200 microliters de tampão de lavagem organoide contendo os anticorpos primários de interesse, e coloque a placa durante a noite a quatro graus Celsius com balanço leve e tremendo a 40 revoluções por minuto.
Na manhã seguinte, adicione um mililitro de tampão de lavagem organoide em cada poço, e permita que os organoides se acomodem no fundo da placa por três minutos. Quando os organoides se instalarem, remova todos, exceto os últimos 200 microliters de cada poço, e lave os organoides com três lavagens de duas horas com um mililitro de tampão de lavagem organoide fresco, e leve balançando e tremendo por lavagem. Após a terceira lavagem, permita que os organoides se instalem na parte inferior da placa por três minutos antes de remover todos, exceto os últimos 200 microliters de tampão de lavagem organoide de cada poço.
Adicione 200 microliters de tampão de lavagem organoide contendo os anticorpos secundários apropriados a cada poço para uma incubação durante a noite a quatro graus celsius com balanço leve e agitação. Na manhã seguinte, lave os organoides com três lavagens de duas horas em um mililitro de tampão de lavagem organoide fresco por lavagem, como demonstrado. Após a última lavagem, transfira os organoides em um tubo de 1,5 mililitro por poço, e colete os organoides por centrifugação.
Para a limpeza óptica dos organoides, remova o máximo de tampão de lavagem de cada tubo possível, sem interromper os organoides, e use uma ponta de pipeta modificada de 200 microliteres para adicionar pelo menos 50 microliters de FUnGI a cada pelota. Após uma incubação de 20 minutos à temperatura ambiente, os organoides podem ser armazenados por até uma semana a quatro graus Celsius, ou por até seis meses a menos 20 graus Celsius. Para preparar slides para imagens organoides por microscopia confocal, encha uma seringa de 10 mililitros com um selante de silicone e conecte uma ponta de pipeta de 200 microliteres modificada à seringa.
Use a seringa para desenhar um retângulo de um por dois centímetros no meio de um slide, e use uma segunda ponta de pipeta de 200 microliter modificada para colocar organoides limpos no meio do retângulo. Para colocar um deslizamento de cobertura sobre os organoides, coloque o lado esquerdo da tampa escorregar primeiro, antes de baixar lentamente o deslizamento da tampa da esquerda para a direita até que não haja ar preso. Em seguida, aplique suavemente pressão em todas as bordas da tampa para fixá-la firmemente ao selante de silicone.
Para fotografar os organoides, coloque o slide no palco de um microscópio de varredura a laser confocal e selecione um objetivo de multi imersão 25 X para imagens confocal. Defina o microscópio para as configurações de aquisição apropriadas, selecionando uma baixa potência laser para reduzir o branqueamento de fotos. Use o modo pilha Z para definir os limites superiores inferiores e defina o tamanho da etapa Z como o ideal.
Ao fotografar grandes estruturas organoides, ou organoides múltiplos juntos, use o modo de revestimento com uma sobreposição de 10% e indique a área de interesse. Quando todos os parâmetros tiverem sido definidos, obtenha uma representação renderizada 3D da imagem no software de imagem e otimize as propriedades de brilho, contraste e renderização 3D. Em seguida, exporte instantâneos RGB dos resultados como arquivos TIFF.
A força da imagem 3D em comparação com a imagem 2D é ilustrada por essas imagens de organoides mamários de camundongos que foram gerados como demonstrado. A camada central desses organoides representativos consiste em células luminosas positivas K8/K18 em forma de coluna, e a camada externa contém células de manjericão k5 positivas alongadas, recapitulando a morfologia da glândula mamária in vivo. Esta organização polarizada é desafiadora de apreciar a partir de uma seção óptica 2D do mesmo organoide.
Outro exemplo de uma estrutura complexa que é impossível de interpretar sem informações 3D é a rede de canaliculi positivo MRP2 que facilitam a coleta do fluido biliar de organoides hepáticos humanos. Além disso, a qualidade e resolução obtidas permitem segmentação semiautomá-automatizada e análise de imagem. Assim, o número total de células e a presença de marcadores podem ser quantificados em subtipos celulares específicos em organoides inteiros.
Ao segmentar os núcleos de um organoide inteiro contendo 140 células, três células que apresentam uma alta positividade para o marcador de ciclo celular Ki67 podem ser identificadas. O agente de compensação óptica, FUnGI, supera a clareira de frutose-glicerol em qualidade de sinal fluorescente no fundo de um organoide. Com organoides liberados do FUnGI demonstrando uma intensidade global de fluorescência aumentada em comparação com organoides não claros.
Observe que qualquer resto de BME na amostra pode resultar em redução da penetração de anticorpos e pode levar a um sinal de fundo alto. Além disso, organoides císticos não devem ser eliminados opticamente se entrarem em colapso. Com pequenas adaptações ao protocolo, as amostras podem ser usadas com super resolução confocal, multi fóton e microscopia de folha de luz.
