O presente protocolo de imagem SEM fornece uma ferramenta para visualizar e quantificar a formação de babados de membrana, saliências circulares e copos macropinócticos na superfície celular in vitro. O SEM fornece imagens de alta resolução da superfície celular que podem ser usadas para visualizar atividades de membrana macropinocística. Esta técnica pode ser usada para descobrir novas vias de sinalização que regulam a macropinocitose, e identificar novos estimuladores e inibidores da micropinocitose.
Comece colocando deslizamentos de tampa de vidro estéreis em poços de uma placa de 24 poços usando fórceps autoclavados. Em seguida, os macrófagos crus de sementes 264,7 na tampa deslizam a uma densidade de 10 a sexta células por mililitro e incubam a placa durante a noite em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5% dióxido de carbono. No dia seguinte, substitua a mídia em cada poço por 500 microliters de mídia completa fresca e, em seguida, pré-trate os macrófagos por 30 minutos com um controle de veículo como dMSO ou um inibidor de macropinocitose como o EIPA.
Em seguida, para promover o babado de membrana, trate as células por 30 minutos com estimuladores de macócitose, como uma solução pma de um micromolar ou 100 nanogramas por mililitro de fator estimulante da colônia macrófago. Para corrigir as células para digitalização de microscopia eletrônica, aspire a mídia dos poços e lave os deslizamentos de tampa duas vezes com PBS gelado, em seguida, incubar os deslizamentos de cobertura em um fixador por 30 minutos à temperatura ambiente seguido de incubação durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, sem perturbar a monocamada celular, lave delicadamente e incuba os deslizamentos de cobertura em 500 microliters de 0,1 motor de cacodilato de sódio por 15 minutos.
Após duas lavagens com 500 microliters de água destilada, lave os deslizamentos de cobertura duas vezes em 500 microliters de uma série de etanol de grau com uma incubação de 10 minutos em cada lavagem. Para realizar a secagem de pontos críticos, coloque os deslizamentos de cobertura em um secador de ponto crítico e cubra-os com 100% de etanol. Em seguida, pressione o botão de alimentação e abra o tanque de dióxido de carbono.
Pressione o botão frio por aproximadamente 30 segundos até que a temperatura diminua para zero graus Celsius. Em seguida, pressione o botão de preenchimento até que uma bolha apareça na janela da câmara. Em seguida, pressione o botão de purga até que o cheiro de etanol do escapamento do expurgo desapareça.
Em seguida, pressione o botão frio novamente até que a temperatura diminua para zero graus Celsius. Pressione os botões completos e expurgo para desligá-los. Então, feche o tanque de dióxido de carbono.
Pressione novamente a parte inferior fria para desligá-la e pressione o botão de calor. Coloque a temperatura em 42 graus Celsius e a pressão para 1.200 libras por polegada quadrada. Uma vez que a pressão e a temperatura estabilizem, pressione o botão de sangramento para permitir que a pressão diminua lentamente.
Uma vez que a pressão da câmara atinja 150 libras por polegada quadrada, pressione o fundo da ventilação e espere até que a pressão diminua para zero libras por polegada quadrada. Desligue o secador de ponto crítico e remova os deslizamentos de cobertura. Em seguida, usando torneiras adesivas de carbono, monte os deslizes de cobertura sobre os suportes de espécime de alumínio para a microscopia eletrônica de varredura, em seguida, proceda ao revestimento sputter usando ouro ou paládio em um revestimento sputter.
Ligue o botão de alimentação do cabresto de sputter. Depois que o vácuo atingir 30 militorrs, lave a câmara para remover a umidade e o ar desligando o interruptor de gás e girando a válvula de gás fina no sentido anti-horário. Uma vez que o vácuo aumenta para 200 militorrs, desligue o interruptor de gás e espere até que o vácuo atinja 30 militorrs.
Em seguida, lave a câmara novamente para remover a umidade e o ar como demonstrado. Depois de lavar a câmara três vezes, empurre o fundo do temporizador e ajuste o botão de tensão até que o medidor leia 10 miliamperes. Em seguida, remova os deslizamentos de cobertura revestidos da câmara.
Para visualizar e quantificar os babados de membrana, insira a tampa da amostra na câmara de um microscópio eletrônico de varredura, feche a porta e pressione o botão de evacuação. Abra o software operacional do microscópio e defina a tensão acelerada para 15 quilovolts e a distância de trabalho para 10 milímetros. Pressione o botão Coordenadas e mova-se ao redor do controlador até que as células apareçam no centro da tela de observação.
Defina a ampliação para 3.500 X e imagem da amostra clicando no botão Foto. Aqui são mostrados imagens representativas de microscopia eletrônica, demonstrando a formação de babados de membrana em macrófagos crus 264,7 após o tratamento com PMA e fator estimulante da colônia de macrófagos. Pré-tratamento de macrófagos com o inibidor de macropinocitose EIPA atenua a formação de babados de membrana.
Durante a formação de babados, a membrana plasmática sofre estágios morfológicos distintos, incluindo uma strusão de membrana semelhante a uma folha, um babado de membrana em forma de C e um copo macropinocítico. A formação de babados de membrana após tratamentos de fatores estimulantes da PMA e colônia macrófago pode ser quantificada por meio da microscopia eletrônica de varredura, enquanto a formação de macropinossomo pode ser confirmada por técnicas alternativas de imagem, como microscopia confocal usando dextran vermelho texas e FM4-64. As setas azuis indicam babados de membrana, enquanto as setas amarela e verde apontam para os micropinossomos.
Finalmente, a macropinocistose pode ser confirmada e quantificada através da citometria de fluxo usando um marcador de fase de fluido fluorescente, como fitc ou dextran vermelho texas. Além do SEM, a análise de imagens de células vivas e a análise de citometria de fluxo da internalização fluorescente do dextran também pode ser realizada para investigar e quantificar a macropinocistose.
