The authors are financially supported by the Swiss National Science Foundation through an operating grant N&#176; 31003A-149566 (to N.D.), and The Sir Jules Thorn Charitable Overseas Trust through a Young Investigator Subsidy (to P.N.).

Declaração de Ética: Todas as manipulações em animais foram realizados em estrita conformidade com as diretrizes do Comitê da Universidade de Genebra Research Animal. 1. Preparação de Metas fagocíticas <ol><li> Adicionar 20 mg de zimosan secou-se para 10 ml de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS). Agitar em vórtice e aquecimento num banho de água a ferver durante 10 min. Arrefecer e centrifugar a 2000 xg durante 5 min. </li><li> Remover o sobrenadante, ressuspender em 1 ml de PBS e sonicado durante 10 minutos num banho de água sonicador. Transferir 500 uL de dois tubos de 1,5 ml. Centrifugar a 11.000 xg durante 5 min. </li><li> Repita a lavagem com 500 mL PBS. O zimosan fervida pode ser dividido em alíquotas, congelada e armazenada a -20 ° C. </li><li> Lavar duas vezes zimosan em 500 ul preparadas de fresco 0,1 M Na 2 CO 3, pH 9,3 como anteriormente (passo 1.2). </li><li> Ressuspender em 490 mL após a lavagem final. Adicionar 10 ul de 10 mg / ml de FITC dissolvido em dimetil sulfoxidE (DMSO), vortex, cobrir com folha, e incuba-se com agitação durante 4 h à TA. </li><li> Para remover o corante não ligado, lavar como indicado acima (passo 1.2), em primeiro lugar com 0,5 mL de DMSO + 150 ul de PBS, em seguida, 0,5 ml de DMSO + 300 ul de PBS, em seguida, 0,5 ml de DMSO + 450 ul de PBS, em seguida, apenas PBS. </li><li> Contagem de zimosan utilizando um hemocitómetro. Adicionar 1 ml de zymosan a 500 ul de PBS, vórtice, em seguida, adicionar 10 ul para a extremidade da câmara de hemocitómetro, onde se encontra com a lamela colocada sobre a grelha central. Montar o hemocitómetro em um microscópio de campo brilhante equipado com uma objectiva 20X. </li><li> Concentre-se no canto superior esquerdo contendo 16 quadrados e contam todas as partículas de zimosan nesta área, utilizando um contador de contagem mão. Repita com o canto inferior direito. Calcular a concentração de zimosan com a seguinte equação: concentração Zymosan = Contagem / 2 x 500 x 10 4 zimosan / ml. Zimosan marcado pode ser dividido em alíquotas, congelada e armazenada a -20 ° C. </li><li> Opsonizar o wi zymosan rotuladath um anticorpo de coelho anti-zimosan na diluição 1: 100. Vortex e incubar durante 1 hora em um banho de água a 37 ° C. Lava-se com 500 ul de PBS como acima (passo 1.2). Nota: A sonicação é altamente recomendada, particularmente depois de opsonização, como zimosan tende a formar grumos que podem tornar mais difícil a análise mais tarde. A opsonização com 65% v / v de soro de rato ou humano podem ser utilizados como uma alternativa. </li><li> Contagem de zimosan utilizando um hemocitómetro como descrito nos passos de 1,7-1,8, e diluir para 100 x 10 6 de partículas / ml. A opsonização com outros estimuladores fagocíticas, tais como o complemento ou nenhuma opsonização, pode ser alternativamente realizada. </li></ol> 2. Live Video Microscopia <ol><li> Isolar neutrófilos primários de ratinho, tal como descrito em detalhe noutro local 38. <ol><li> Como alternativa, use qualquer tipo de célula fagocitária. Manter em gelo neutrófilos no Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado com 5% de soro de vitelo fetal (v / v), 200 U de penicilina / streptomycin, a uma concentração de 10 x 10 6 células / ml até estar pronto para utilização. Outros tipos de células podem ser semeadas 1-4 dias antes. </li></ol></li><li> Adicionar 2 x 10 5 (20 ul) de neutrófilos para o centro de um prato de 35 mm com fundo de vidro, gota a espalhar pela adição de 50 uL de meio e incubar a 37 ° C durante 5 min para permitir que as células a aderirem. </li><li> Adicionar 1 ml de solução salina equilibrada de Hank (HBSS) aquecido a 37 ° C contendo o inibidor de MPO específico hidrazida 4-aminobenzóico (4-ABH, 10 uM). Os inibidores não-específicos de MPO, tais como azida de sódio (5 mM), também podem ser usados, mas têm sido sugeridos recentemente para exercer efeitos não-específicos adicionais de pH 39. </li><li> Montar o prato num microscópio de campo amplo de fluorescência equipado com um sistema de aquecimento de 37 ° C e uma objectiva de óleo de 40X. Incubar as células sem imagem durante 10 min para permitir que as células e material para equilibrar. </li><li> Ajuste as configurações de microscópio para adquirir uma imagem de transmissão de campo brilhante [phase ou contraste de interferência diferencial (DIC) se disponível] com 440 nm ou 490 nm de excitação e 535 nm de emissão a cada 30 seg. </li><li> Ajuste o tempo de exposição e freqüência de aquisição de acordo com o sistema de microscópio para evitar o excesso de fotodegradação e fototoxicidade e, dependendo das questões experimentais sejam colocadas. Comece a aquisição de imagem. </li><li> Após 2 minutos, adicionam-se 10 x 10 6 (50 ul) pelo zimosan opsonizado com FITC para o centro do prato. Ajuste alvo: rácios de células, dependendo do tipo de fagócitos e alvo utilizado. </li><li> Continuar imagiologia durante 30 min. Após 30 min parar a aquisição de lapso de tempo e iniciar um temporizador. Mova o palco e capturar 10 ou mais instantâneos em diferentes campos de visão a imagem outros phagosomes, tudo dentro de 5 min. </li></ol> 3. Calibração e Controle de Experimentos <ol><li> Prepare as soluções de calibração pH (receitas estão descritos na Tabela 1) antes do dia de experimento e congelar em alíquotas de 10 ml.Descongelar as soluções de calibração e aquecer até 37 ° C num banho de água. Verificar o pH com um medidor de pH e registrar o pH real de soluções. </li><li> Montar uma bomba peristáltica na parte inferior prato de vidro antes da aquisição da imagem e realizar microscopia de vídeo ao vivo como descrito acima (seção 2). </li><li> No final do período de aquisição 30 min ligar a bomba para remover a solução dentro do prato, adicionar 1 ml da primeira solução de calibração e parar a bomba. </li><li> Aguarde até que o sinal estabilize, geralmente 5 min. Repita com cada solução de calibração. <ol><li> Executar, pelo menos, uma calibração por dia experimental, calibrar e começando com o mais elevado pH e trabalhando sequencialmente para o mais baixo, bem como a partir do pH mais baixo e trabalhar sequencialmente para o mais alto. </li></ol></li><li> Como um controlo, adicionar 100 uL de 100 uM de inibidor de NADPH-oxidase iodeto difenil propionium (DPI), diluída em HBSS para as células em 900 ul de HBSS no prato de vidro de fundo, eincube durante 10 min. </li><li> Comece aquisição e adicionar zymosan como acima (passo 2.7). Após 15 min de fagocitose, adicionar 10 ul de 10 mM de inibidor V-ATPase concanamycin A (ConcA) diluídos em HBSS e continuar imagiologia durante mais 15 minutos adicionais. </li></ol> 4. Análise <ol><li> Análise de filmes de lapso de tempo e instantâneos fagosoma. Nota: As instruções a seguir são específicos para ImageJ. Passo-a-passo as instruções podem variar muito, dependendo do software utilizado, mas as funções descritas nesta seção estão disponíveis na maioria dos softwares de análise de imagem profissional. <ol><li> Abra as imagens com software de análise de imagem profissional. Subtrair o fundo no canal 490 por desenhar um pequeno quadrado ROI com a ferramenta de seleção polígono quadrado em uma área onde não há células e clicando em Plugins&gt; BG Subtração de ROI. Em seguida, fazer o upload do mesmo ROI no canal 440, clicando em Editar&gt; Seleção&gt; Restaurar seleção e repita. </li><li>Faça uma imagem de relação de 32-bit do 490 canal dividido pelo canal 440, clicando em Processo&gt; Calculadora da imagem ..., selecionando as imagens apropriadas nos menus drop-down Image1 e Image2, em seguida, selecionando &#39;Divide&#39; no menu drop-down Operação e verificando resultado caixa de seleção de 32 bits (float). </li><li> Alterar tabela de consulta a codificação de cores para uma codificação de cores proporção compatível clicando Image&gt; Tabelas de Pesquisa&gt; Rainbow RGB. Limite a relação da imagem para eliminar a 0 e infinito pixels clicando Image&gt; Adjust&gt; Threshold .... Ajuste as barras de rolagem para que zymosan aparece em vermelho e clique em Aplicar, certificando-se os Set pixels de fundo caixa de seleção para NaN é selecionado. </li><li> Combine isso pilha relação com o canal de campo brilhante em um composto multi-canal clicando em Imagem&gt; Cor&gt; Mesclar Canais, e seleccionando a imagem de campo brilhante no menu canal suspenso cinza ea imagem relação no menu dropdown canal verde, e seleccionando oMantenha imagens de origem check-box. Digitalizar os filmes de lapso de tempo ou instantâneos para determinar quais phagosomes estão a ser analisadas. O canal de campo brilhante é útil para este. </li><li> Desenhe regiões de interesse (ROI) usando a ferramenta de seleção polígono oval em torno phagosomes, e adicioná-los para o gerente ROI clicando Analisar&gt; Ferramentas&gt; ROI Manager&gt; Adicionar. Meça o seu rácio de intensidade zymosan clicando em Mais&gt; Multi-Measure e de-selecionar o Uma linha fatia check-caixa por. </li><li> Para filmes de lapso de tempo, trilha fagossomos um de cada vez, desenhando um ROI, digitando Ctrl + M para medir cada ponto de tempo, e movendo o ROI quando necessário para rastrear valores de intensidade ao longo do tempo. Copie as medidas da janela de resultados em um software de planilha. Nota: Análise de 15 (5 cursos de tempo por experimentação x 3) experiências independentes é ideal, mas mais ou menos pode ser necessária, dependendo da variabilidade observada. Guardar as ROIs é sempre recomendável. Alguns pacotes de software permitem que regi imagemstration e atualização dinâmica de ROIs, facilitando dessa parte da análise. </li></ol></li><li> A conversão de fluorescência a valores de pH <ol><li> Medir a razão 490/440 para phagosomes na calibração filmes de lapso de tempo como descrito na seção 4.1. </li><li> Em uma planilha, traçar os valores da relação com o tempo, e calcular os valores médios da relação de todos os phagosomes dentro do campo de visão (geralmente, entre 5-20) a partir de 5 pontos temporais no meio do período de tempo correspondente a cada calibração de pH solução. (Veja também as caixas vermelhas na Figura 5A.) </li><li> Traçar estas médias de 490/440 valores da razão contra o pH de medição atual. Combinar pelo menos 3 calibrações independentes num único gráfico. Use um pacote de software estatístico ou numérica para executar uma regressão não linear (curva de melhor ajuste), geralmente a uma equação sigmoidal. Nota: Por exemplo, na Figura 5B a equação utilizada foi uma sigmoidal de Boltzmann [Y = Fundo + ((Top-Bottom)/ (1 + EXP ((V50-X) / Slope))], onde valores Y são as relações 490/440, X são os valores de pH e parte superior, inferior, parâmetros V50 e inclinação são calculados pelo software. </li><li> Use a equação obtida para transformar valores da relação de pH. Nota: Por exemplo, na Figura 5B da equação obtida para a curva de calibração na presença de azida de sódio é Rácio 490/440 = 1,103 + [(2,89-1,103) / (1 ​​+ EXP ((6,993-pH) /0.9291)] . Resolvendo para pH dá a seguinte equação: pH = 6,993-0,9291 * [LN ((1.178 / (Ratio-1.103)) - 1))]. </li></ol></li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosomal+proteolysis+in+dendritic+cells+is+modulated+by+NADPH+oxidase+in+a+pH-independent+manner.">Phagosomal proteolysis in dendritic cells is modulated by NADPH oxidase in a pH-independent manner.</a> EMBO J. 31 (4), 932-944 (2012).</li><li>Mantegazza, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+controls+phagosomal+pH+and+antigen+cross-presentation+in+human+dendritic+cells.">NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells.</a> Blood. 112 (12), 4712-4722 (2008).</li><li>Balce, D. R., Allan, E. R., McKenna, N., Yates, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gamma-Interferon-inducible+lysosomal+thiol+reductase+(GILT)+maintains+phagosomal+proteolysis+in+alternatively+activated+macrophages.">gamma-Interferon-inducible lysosomal thiol reductase (GILT) maintains phagosomal proteolysis in alternatively activated macrophages.</a> J Biol Chem. 289 (46), 31891-31904 (2014).</li><li>Sanjurjo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scavenger+protein+apoptosis+inhibitor+of+macrophages+(AIM)+potentiates+the+antimicrobial+response+against+Mycobacterium+tuberculosis+by+enhancing+autophagy.">The scavenger protein apoptosis inhibitor of macrophages (AIM) potentiates the antimicrobial response against Mycobacterium tuberculosis by enhancing autophagy.</a> PLoS One. 8 (11), e79670 (2013).</li><li>Yuan, Z., Zhi, L., Li-Juan, Z., Hong-Tao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Utility+of+Chloroquine+in+Cancer+Therapy.">The Utility of Chloroquine in Cancer Therapy.</a> Curr Med Res Opin. , 1-12 (2015).</li><li>Ohkuma, S., Poole, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+probe+measurement+of+the+intralysosomal+pH+in+living+cells+and+the+perturbation+of+pH+by+various+agents.">Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 75 (7), 3327-3331 (1978).</li><li>El Chemaly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VSOP/Hv1+proton+channels+sustain+calcium+entry,+neutrophil+migration,+and+superoxide+production+by+limiting+cell+depolarization+and+acidification.">VSOP/Hv1 proton channels sustain calcium entry, neutrophil migration, and superoxide production by limiting cell depolarization and acidification.</a> J Exp Med. 207 (1), 129-139 (2010).</li><li>Levine, A. P., Duchen, M. R., Segal, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HVCN1+channel+conducts+protons+into+the+phagocytic+vacuole+of+neutrophils+to+produce+a+physiologically+alkaline+pH.">The HVCN1 channel conducts protons into the phagocytic vacuole of neutrophils to produce a physiologically alkaline pH.</a> bioRxiv. , (2014).</li><li>Al-Fageeh, M. B., Smales, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+and+regulation+of+the+cellular+responses+to+cold+shock:+the+responses+in+yeast+and+mammalian+systems.">Control and regulation of the cellular responses to cold shock: the responses in yeast and mammalian systems.</a> Biochem J. 397 (2), 247-259 (2006).</li><li>Yui, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basolateral+targeting+and+microtubule-dependent+transcytosis+of+the+aquaporin-2+water+channel.">Basolateral targeting and microtubule-dependent transcytosis of the aquaporin-2 water channel.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 304 (1), C38-C48 (2013).</li><li>Griffiths, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+phagosome+individuality+and+membrane+signalling+networks.">On phagosome individuality and membrane signalling networks.</a> Trends Cell Biol. 14 (7), 343-351 (2004).</li><li>Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+regulation+of+the+mitochondrial+proton+gradient+during+cytosolic+calcium+elevations.">Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations.</a> J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Apesar de ser mais demorada do que os métodos alternativos, tais como a espectroscopia e FACS, que empregam uma estratégia semelhante de um corante utilizando sensível ao pH acoplado a alvos mas medir o pH médio de uma população de fagossomas, microscopia oferece várias vantagens. Primeiro é que interno e externo ligado, mas não internalizadas, as partículas podem facilmente ser distinguidos sem ter que adicionar outros produtos químicos, tais como azul de tripano ou anticorpos, para extinguir ou rotular part...

Phagocytosis, the process through which innate immune cells engulf large particles, evolved from the eating mechanism of single-celled organisms, and involves binding to a target, enveloping it with a membrane and pinching the membrane off to form a vacuole within the cytosol called a phagosome. While the phagosomal membrane is derived from the plasma membrane, active protein and lipid sorting, as well as fusion with endomembranes during phagosome formation, transform the phagosome into a distinct organelle within the cell with degradative properties that allow the killing, neutralization and breakdown of the ingested material1-3. This process, called phagosomal maturation, relies on the delivery of a host of proteolytic and microbicidal enzymes, including the nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase which transfers electrons into phagosomes producing the strong oxidant O2- and its derivative reactive oxygen species (ROS) 2,4. 
The luminal pH of phagosomes has a profound influence on several events required for phagosome function. First, pH influences trafficking of endomembranes in general, as pH-dependent conformational changes of transmembrane trafficking regulators alters the recruitment of trafficking determinants such as Arfs, Rabs and vesicular coat-proteins, which in turn define which vesicles may fuse with phagosomes 5-8. Second, the ionic composition of the phagosomal lumen is also transformed as phagosomes mature, and some ion transporters, such as the Na+/H+ exchanger or ClC family Cl-/H+ antiporters, which promote phagocytic function, rely on H+ translocation 9,10. Similarly, ROS production is intimately linked with phagosomal pH. ROS and its toxic oxidant byproducts have long been recognized as crucial for phagosomal killing in neutrophils 4,11,12, and have been shown to play critical roles in other phagocytes including macrophages, dendritic cells (DCs) and amoeba 13-16. The NADPH oxidase is an electrogenic enzyme that releases H+ in the cytosol as NADPH is consumed, and that requires the simultaneous transfer of H+ through companion HVCN1 channels alongside the transported electrons into the phagosomal lumen, in order to alleviate the massive depolarization that would otherwise lead to self-inhibition of the enzyme 17-21. Finally, several proteolytic enzymes have optimal activity at different pH, so time-dependent phagosomal pH changes can influence which enzymes are active and when. The importance of phagosomal pH is highlighted by organisms such as Mycobacterium tuberculosis, Franciscella tularensis and Salmonella typherium that subvert phagocytic killing at least in part by altering phagosomal pH 22-24.
In mammals the main phagocytes are neutrophils, macrophages and dendritic cells, and depending on cell type, time-dependent phagosomal pH changes can vary widely, and appear to play different roles. In macrophages a strong and rapid acidification mediated by the ATP-dependent proton pump vacuolar ATPase (V-ATPase) is one of the key factors mediating killing 25-27, resembling the mechanisms present in amoeba that use phagocytosis as an eating mechanism 28. In these cells activation of acidic proteases is thought to play a key role. In contrast, neutrophil killing relies more on ROS as well as HOCl produced by myeloperoxidase (MPO)11, and the pH remains neutral or alkaline during the first 30 min acidifying only later 29,30. Neutral pH has been suggested to favor the activity of oxidative proteases such as certain cathepsins. In DCs phagosomal pH is controversial, with some reporting acidification and others neutral or alkaline pH 31,32, but ROS and pH may profoundly influence the ability of these cells to present antigens to T cells, one of their main functions 33. 
Importantly, hormones, chemokines and cytokines may produce signaling events that induce maturation and changes in phagocyte behavior, and in turn influence phagosomal pH 34,35. Similarly, drugs, for example the antimalarial chloroquine, which is also considered for anti-cancer therapies 36, may affect phagosomal pH and therefore immune outcomes. Thus, a variety of cell biologists, immunologists, microbiologists and drug developers may be interested in measuring phagosomal pH when seeking to understand the mechanisms underlying the effects of a particular genetic disruption, bioactive compound or microorganism on innate and adaptive immune responses. 
Here we describe a method for measuring phagosomal pH in neutrophils that allowed us to show the importance of the HVCN1 channel in regulating neutrophil phagosomal pH 19. The method is based on the ratiometric property of fluorescein isothiocyanate (FITC) whose fluorescence emission at 535 nm is pH sensitive when excited at 490 nm but not 440 nm 37. When this dye is chemically coupled to a target, in this case zymosan, it can be followed using wide-field fluorescence microscopy, where cells are imaged as they phagocytose, and phagosomal pH changes are measured in real time as the phagosome matures. The actual pH is then gleaned by performing a calibration experiment where cells that have phagocytosed are exposed to solutions of different pH that contain the ionophores nigericin and monensin, that allow the rapid equilibration of the pH within phagosomes with the external solution. Ratio values are then compared to the known pH of solutions, a calibration curve is constructed by nonlinear regression and the resulting equation used to calculate pH from the ratio value.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Zymosan A powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z4250</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7250</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-zymosan antibody (Zymosan A Bioparticles opsonizing reagent)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Z2850</td>
			<td>Sigma-Aldrich O6637 is an equivalent product. Alternatively 25% serum can be used as an opsonizing reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Aminobenzoic hydrazide (4-ABH)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-204107</td>
			<td>Toxic, use gloves, various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diphenyleneiodonium chloride (DPI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2926</td>
			<td>Toxic, use gloves, various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanamycin A (ConcA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27689</td>
			<td>Toxic, use gloves, various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7143</td>
			<td>Toxic, use gloves, various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monensin</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>ALX-380-026-G001</td>
			<td>Toxic, use gloves, various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14200-075</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balance salt solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td>Ringer&#39;s balanced salt solution or other clear physiological buffers may be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate (Na2CO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7795</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671&#160;</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methyl-D-glucamine (NMDG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2004&#160;</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3777</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503&#160;</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol (EtOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>2860</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom 35 mm petri dishes (Fluorodish)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td>Ibidi &#181;-clear dishes or coverslips with appropriate imaging chambers may be sustituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicating water bath</td>
			<td>O. Kleiner AG</td>
			<td></td>
			<td>A sonicator may be used instead, various instrument providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heamocytometer</td>
			<td>Marienfeld GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Various instrument providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield live imaging microscope</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Various instrument providers exist, but the microscope must be able to image 440/535 and 490/535 excitation/emission respective. Spinning disk confocal set-ups with brightfield capabilities may substituted, but zymosan tend to go out of focus more often.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump (Dynamax RP-1)</td>
			<td>Rainin</td>
			<td></td>
			<td>Various instrument providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Schott Gerate GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Various instrument providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Counter</td>
			<td>Milian SA</td>
			<td></td>
			<td>Various instrument providers exist</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring phagosome ph by ratiometric fluorescence microscopy

A fagocitose é um processo fundamental através do qual as células imunes inatas engolir bactérias, células apoptóticas ou de outras partículas estranhas, a fim de matar ou neutralizar o material ingerido, ou apresentá-lo como antigénios e iniciar respostas imunes adaptativas. O pH de fagossomas é um parâmetro crítico de fissão regulação ou fusão com endomembranas e activação de enzimas proteolíticas, eventos que permitem que o vacúolo fagocítica de amadurecer em um organelo degradativa. Além disso, a translocação de H + é necessária para a produção de níveis elevados de espécies reactivas de oxigénio (ROS), as quais são essenciais para a morte eficiente e de sinalização a outros tecidos do hospedeiro. Muitos patógenos intracelulares subverter assassinato phagocytic limitando phagosomal acidificação, destacando a importância do pH em biologia phagosome. Descrevemos aqui um método para a medição raciométrica phagosomal pH em neutrófilos usando isotiocianato de fluoresceína (ITCF) marcado com zimosano como fagocítica targets e geração de imagens de células vivas. O ensaio baseia-se nas propriedades de fluorescência do FITC, que é extinta por pH acídico, quando excitado a 490 nm, mas não quando excitado a 440 nm, permitindo a quantificação de uma relação dependente do pH, em vez de fluorescência absoluta, de um único corante. Um protocolo detalhado para a realização do corante calibração in situ e a conversão de relação a valores de pH verdadeiro também é fornecido. -Dye único raciométrica métodos são geralmente considerado superior ao comprimento de onda único ou protocolos pseudo-ratiometric dual-dye, como eles são menos sensíveis a perturbações tais como o branqueamento, o foco alterações, variações laser e rotulagem irregular, que distorcem o sinal medido. Este método pode ser facilmente modificado para medir o pH em outros tipos de células fagocíticas, e zymosan pode ser substituído por qualquer outra partícula contendo amina, a partir de drageias inertes para os microorganismos vivos. Finalmente, este método pode ser adaptada para fazer uso de outras sondas fluorescentes sensíveis a diferentes gamas de pH ou outro phagosomatividades de al, tornando-se um protocolo generalizado para a imagiologia funcional de phagosomes.

A seguir, são resultados representativos para um experimento onde o pH phagosomal de neutrófilos primários de rato isolados da medula óssea de tipo selvagem ou Hvcn1 - / - ratinhos foram comparados. Para uma experiência bem sucedida, é importante para obter phagosomes suficientes dentro do campo de visão durante toda a duração do filme de lapso de tempo, evitando muitas phagosomes, que mais tarde serão mais difíceis de segmento durante a análise de imagem. A Figura 1 mo...

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Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Phagosomal pH influences phagosome maturation, oxidant production, phagosomal killing as well as antigen presentation. Here we describe a ratiometric method for measuring time-course and endpoint pH changes in individual phagosomes in living phagocytes using fluorescence microscopy.

Medindo phagosome pH Raciometrico por microscopia de fluorescência

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

measuring-phagosome-ph-by-ratiometric-fluorescence-microscopy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.8K visualizações.  University of Geneva. Phagosomal pH influences phagosome maturation, oxidant production, phagosomal killing as well as antigen presentation. Here we describe a ratiometric method for measuring time-course and endpoint pH changes in individual phagosomes in living phagocytes using fluorescence microscopy. 