O objetivo deste procedimento é determinar a produção de glicose hepática em uma síndrome do ovário policístico, ou modelo de rato PCOS. O metabolismo de glicose disregulado é uma manifestação importante do SPC e é a chave para sua patogênese. Portanto, estudos envolvendo avaliação do metabolismo da glicose no PCOS são de extrema importância.
Neste estudo, discutimos instruções passo a passo para a quantificação da taxa de produção de glicose hepática em um modelo de rato PCOS medindo o M mais dois enriquecimento de seis seis glicoses delutratadas, um rastreador de glicose isotópico estável, via cromatografia gasosa, espectrometria de massa ou GCMS. Este procedimento envolve a criação de uma solução estável de rastreador de glicose isotópica, uso de colocação de cateter de veias traseiras e infusão do rastreador de glicose em estados ricos em jejum e glicose no mesmo rato em conjunto. Um dia antes do procedimento, prepare o rastreador de glicose isótopo estável em soro fisiológico normal.
Para este experimento, a produção de glicose durante o jejum em condições ricas em glicose foi medida para que o isótopo de glicose fosse preparado em duas preparações diferentes. O rastreador foi preparado em condições estéreis, dissolvendo seis seis glicose desfetada e estéril de cloreto de sódio de 0,9% com ou sem glicose. O primeiro infusor foi preparado apenas com o rastreador.
O segundo infundado continha tanto o rastreador quanto a glicose não otópica. Uma vez preparados as soluções, foram filtradas estéreis com o filtro de 0,22 míccro e armazenadas a quatro graus Celsius. As soluções foram preparadas de tal forma que a dose final de infusão foi próxima de um miligrama por quilograma e minuto e dois miligramas por quilograma e minuto, respectivamente.
Para a medição da taxa de glicose durante a condição basal em condição rica em glicose, foi utilizada uma infusão média de taxa constante de seis seis glicoses desatadas a 1,08 miligramas por quilograma e minuto e 1,9 miligramas por quilograma em minuto, respectivamente. Para imitar o estado alimentado, empregamos uma taxa média de infusão d-glicose de 18,8 miligramas por quilograma e minuto durante a condição rica em glicose. Remova os ratos de suas gaiolas domésticas, e coloque-os em suas gaiolas de jejum três horas antes do início do experimento.
Para este experimento, usamos camundongos fêmeas de quatro meses da cepa C57BL6J. Monte o equipamento de caging agrupando os ratos em um número definido de ratos por bomba de insulina. Coloque divisórias em cima de uma base plana e estável para fazer baias individuais para os ratos.
As gaiolas são claras e feitas de plexiglass. Há uma base plana e estável sobre a qual as divisórias se sentam. A porta da gaiola desliza para fechar e tem um entalhe na parte inferior para permitir que a cauda se encaixe.
Monte as seringas contendo um mililitro de infusão basal e conecte-se à tubulação de bomba de infusão usando o tubo de polietileno. Prepare a bomba de infusão definindo a taxa para 150 microliters por hora, que é a taxa basal. Aqueça um banho de água a 48 graus Celsius.
Prepare a estação de inserção do cateter adjacente ao banho de água contendo agulhas de meia polegada de calibre 30, tubos silasticos e fita de transporte clara de uma polegada. Selecione um mouse e coloque-o em um suporte seguro com acesso à cauda. Coloque um pedaço de fita sobre a porção proximal da cauda para permitir espaço para a inserção do cateter de forma mais distral.
Leve o rato para o banho de água e insira a cauda no banho de água por aproximadamente 30 a 45 segundos. Isso ajuda a dilatar a vasculatura da cauda para a colocação do cateter. A inserção do cateter deve ser feita em condições estéreis.
Uma vez que a cauda esteja aquecida, limpe a cauda e coloque um pequeno grampo de jacaré desdentado de cobre como um torniquete na extremidade proximal da cauda. Visualize a veia lateral da cauda sob uma lupa. Em seguida, insira cuidadosamente o cateter na veia da cauda e lave a solução suavemente para garantir a patência do cateter.
Enrole um pedaço de fita de transporte ao redor do local de inserção para fixar o cateter e remova o pequeno torniquete da cauda. Coloque o mouse em sua gaiola individual e feche a porta de correr, garantindo que a cauda esteja saliente através do entalhe e permaneça fora da gaiola. Coloque um pedaço adicional de fita sobre todo o cateter e a cauda para fixá-lo na placa base da gaiola.
Desconecte a descarga do cateter da veia da cauda e coloque o pequeno grampo na tubulação silastica do cateter para evitar o fluxo de volta enquanto conecta a linha infundida da bomba. Uma vez conectado com segurança, remova o grampo e lave a solução de escoramento que consiste no infusor. Certifique-se de que a solução está clara no tubo e não manchada de sangue.
Uma vez que as linhas de infusão estejam funcionando corretamente, remova a tampa do mouse. Coloque a cama padrão ao redor do mouse. Inicie a infusão com o infusor contendo o rastreador e execute-o por três horas continuamente.
Durante a duração da infusão, continue a verificar o bem-estar dos ratos, bem como as linhas de infusão. Certifique-se de que a tubulação de infusão está devidamente protegida e que não há vazamentos dos pontos de conexão da linha. Após a conclusão da primeira infusão, pare a infusão e coloque um grampo na tubulação do cateter para evitar o fluxo de volta.
Removeu suavemente os ratos de seus recintos sem perturbar o cateter para coletar sangue. Para este experimento, os camundongos foram submetidos a perfuração da veia da bochecha usando uma lança de quatro milímetros. Colete aproximadamente 75 microliters de sangue no frasco desejado.
Para desproteinizar amostras em preparação para espectrometria de massa, adicione aproximadamente 15 microliters de sangue a 500 microliters de acetona. O sangue restante pode ser usado para verificar o nível de glicose no sangue via glucometer e/ou uma centrífuga para separar o plasma para futuros ensaios hormonais. Remova o infundato das bombas de seringa desconectando o tubo das seringas e substitua-o pelo segundo rastreador contendo infundado junto com a glicose.
Repita os passos de infusão anteriores usando a infusão de glicose isotópica rica em glicose. Para atingir o estado estável, execute um bolus do segundo infusor a 600 microliters por hora durante 15 minutos. Observe o horário de partida para cada grupo de gaiolas.
Diminua a taxa de infusão para 150 microliters por hora para completar as três horas de tempo total de infusão. Repita a amostragem de sangue como descrito anteriormente. Desconecte as infusões, aplique pressão nos locais do cateter até que o sangramento pare e devolva os ratos para suas gaiolas domésticas.
Em seguida, as amostras são enviadas para gcms. Calcule o enriquecimento isotópico do isótopo de glicose sob o pico de glicose por GCCMS usando o derivado do pentaacetato. Resumidamente, este método envolve a preparação do derivado pentaacetato da glicose, seguido da análise amostral utilizando GCMS no modo de ionização química positiva.
O monitoramento seletivo de íons da relação massa-carga, 171 a 169, é realizado para determinar o M mais dois enriquecimento do isótopo de glicose. Todas as medidas cinéticas são realizadas assumindo condições estáveis do estado. Calcule a taxa total de aparência de glicose plasmática a partir do M mais dois enriquecimento do isótopo de glicose e plasma usando equações de diluição de isótopos estabelecidas.
Em condições estáveis do estado, supõe-se que a taxa de aparecimento de glicose é igual à taxa de desaparecimento da glicose. Taxa de produção de glicose endógena é igual a taxa total de glicose plasmática menos glicose exógena. A tabela um inclui os resultados representativos do estudo.
Todas as unidades são expressas como miligramas por quilograma e minuto. Usando equações de diluição de isótopos descritas anteriormente, calculou-se a taxa total de glicose plasmática. No grupo controle, a taxa média de glicose de aparência foi de 19,98 no estado de jejum.
Em condições ricas em glicose, a taxa de glicose de aparência foi de 25,8. A taxa de produção de glicose foi de 19,08 no estado de jejum e de 8,56 no estado rico em glicose. Metabolismo anormal de glicose e homeostase são comuns em PCOS.
Em desordens do metabolismo anormal da glicose, a regulação da supressão da produção de glicose está comprometida levando à hiperglicemia. Neste estudo, descrevemos uma maneira simples de medir a taxa de produção de glicose hepática em vários camundongos ao mesmo tempo. Os componentes críticos deste experimento são a inserção do cateter e a definição das medidas exatas do isótopo de glicose e da glicose natural, a fim de realizar adequadamente a GCMS.
As vantagens do estudo é realizar a infusão de forma minimamente invasiva devido à inserção do cateter da veia da cauda, bem como o uso de um rastreador de glicose facilmente alcançável e estável. Existem algumas limitações para o estudo, incluindo a demanda técnica do procedimento e a necessidade de possíveis habilidades adicionais. No geral, descrevemos uma maneira simples e precisa de medir a taxa de produção total de glicose hepática em um modelo de mouse PCOS.
Essa técnica pode servir de base para múltiplos estudos envolvendo o metabolismo de glicose de modelos de camundongos.
