Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da reprodução. E a endocrinologia. E são aplicáveis ao estudo da Síndrome do Ovário Policístico ou PCOS e hiperandrogenismo.
A vantagem deste técnico é que ele facilita uma liberação consistente, uniforme e de longo prazo de hormônios de uma maneira econômica e cara. JHUs tratando o procedimento será Ping Xue, um técnico do meu laboratório. Para a preparação da dihidrotestosterona ou dht, use uma lâmina de barbear para cortar um pedaço de tubo de silicone de 15 milímetros.
E use uma seringa de três mililitros equipada com uma agulha de calibre 20 para injetar silicone adesivo médico de dois a cinco milímetros em uma extremidade do tubo. Deixe a tubulação secar durante a noite. E verifique se há bolhas de ar na extremidade selada.
O uso dos equipamentos de proteção individual apropriados despeje pó DHT em um barco de plástico na vazão. Impressione a extremidade aberta do tubo de tampa adesiva no pó. Usando um grande clipe de papel endireitado, tampe o pó para baixo na tubulação, até que o DHT atinja a profundidade experimental apropriada.
Em seguida, sele o lado aberto do tubo com silicone durante a noite. Na manhã seguinte, corte cada lado selado para obter um comprimento de dois milímetros de silicone em ambos os lados do DHT e sem pelotas de controle DHT. Em seguida, armazene as pelotas no tubo cônico de 50 mililitros embrulhado com papel alumínio à temperatura ambiente por até três meses.
Para a geração de modelos de mouse PCOS equilibre até 20 DHT ou controle pelotas em tubos cônicos separados de 50 mililitros contendo 30 mililitros de 0,9% de soro fisiológico por 24 horas a 37 graus Celsius. No dia seguinte, confirme a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé em um camundongo fêmea anestésimo de dois meses de idade e use gaze estéril para administrar povidone-iodo sequencial e 70% de ethynol esfrega na área cirúrgica. Em seguida, faça uma incisão de cinco milímetros através da pele perto do pescoço.
E use um trocarte de 10 metros para fazer um túnel de 15 milímetros na direção rostral. Use o trocarte para inserir uma pelota dorsalmente no túnel e selar a incisão com o adesivo cirúrgico. Aproxime manualmente as bordas da ferida com fórceps e use pinceladas suaves para aplicar três finas camadas de filme de adesivo líquido a um centímetro de cada lado das bordas opostas da ferida.
Em seguida, coloque o mouse sozinho em uma gaiola em uma almofada de calor com monitoramento até a recumbência total. Substituindo a pelota a cada quatro semanas para manter um nível constante de exposição andrógena. Três dias após a inserção da pelota, use uma pipeta p10 para esguichar dez microlitadores de soro fisiológico estéril na cavidade vaginal e usar a ponta da pipeta para recuperar imediatamente o soro fisiológico.
Espalhe a amostra de soro fisiológico da célula vaginal em um slide rotulado. E deixe o soro fisiológico secar à temperatura ambiente. Fixar os slides secos em um recipiente de 100% de ethynol por pelo menos cinco minutos.
Em seguida, colori as lâminas por um minuto cada em buffer B e tampão C de um kit de coloração dif-rápido. No final da incubação do buffer C lave os slides com água da torneira por três segundos e seque-os à temperatura ambiente. Para determinar a cíclica estrous, veja os slides sob o objetivo de dez vezes de um microscópio leve.
Conte os dias em cada etapa e divida pelo número total de dias para calcular o tempo percentual em cada etapa. Para testar a tolerância à glicose, 20 dias de inserção de DHT, jejue os ratos durante a noite. Pesar os camundongos na manhã seguinte, e usar um glucometer e tiras de teste para medir o nível de glicose de manjericão do sangue da veia da cauda.
Injete os camundongos com dois gramas por quilograma de peso corporal de 20% de dextrose. Em seguida, meça o nível de glicose das amostras de sangue da veia da cauda em 15, 30, 60, 90, 120 minutos após a administração de dextrose. Para adquirir descendentes fêmeas de damas inseridas dht, mova o camundongo fêmea para testado na gaiola com um macho fértil comprovado no dia 15, após a inserção de pelotas.
Documente o peso corporal das mulheres toda semana para determinar se o rato está grávida. No sétimo dia pós-natal, mergulhe uma ponta de lanceta na pasta de tatuagem e marque cada filhote com uma tatuagem no dedo do pé. Pese os ratos marcados a cada sete dias até os 70 dias de idade.
Entre a data pós-natal de 12 a 16 anos, a orelha soca os ratos para numerar de acordo com o sistema como ilustrado na figura. Para distinguir o sexo, examine o lado ventral de cada rato marcado. As fêmeas terão mamilos visíveis.
Para coletar amostras de sangue para várias análises a jusante, use uma lanceta para coletar o volume experimental aproximado de sangue entre nove e dez da manhã por sangramento da veia submandibular. E centrifugar as amostras para permitir a coleta de soro. Em seguida, armazene as amostras de soros em tubos microcentrífugas de 1,5 mililitro a menos 80 graus Celsius até sua análise.
Para avaliar a puberdade na prole feminina dht, todos os dias após o desmamar no pós-natal dia 21, verifique a abertura vaginal por inspeção visual. E usar calibres para medir a distância ano-genital. Embora os valores absolutos do soro DHT sejam diferentes entre espectrometria de massa e análise de Elisa, a mudança folclórica relativa da inserção DHT versus não-DHT é semelhante tanto quanto entre os ensaios e entre os experimentos.
Os níveis de DHT são significativamente aumentados da pré-concepção através da gravidez tanto em DHT quanto em nenhum camundongo DHT. No entanto, os níveis de DHT são duas vezes maiores em camundongos DHT em comparação com nenhum camundongo DHT em pontos de tempo pré-concepcionais e gestacionais. Filhas adultas do DHT apresentam diferenças na função reprodutiva.
Por exemplo, a ciclicidade eestrosa interrompida em comparação com as filhas adultas sem DHT experimentando tempos significativamente mais longos em metestrus diestrus e menos tempo em pro-esterosos e esterosos. Ao tentar este procedimento é importante lembrar de incubar as pelotas por 24 horas antes de serem usadas para a liberação uniforme do hormônio. Após este procedimento, as consequências reprodutivas e metabólicas da exposição ao DHT também podem ser examinadas.
Após seu desenvolvimento, este técnico abriu caminho para pesquisadores do campo da endroocronologia e interações fetais maternas estudarem PCOS e o impacto do hiperandrogenismo de baixo nível em camundongos femininos. Não se esqueça que trabalhar com DHT pode ser extremamente perigoso e as precauções como usar luvas e máscara e óculos, e trabalhar em um capuz de biosegurança, devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.
