Caracterizamos os mecanismos in vivo de extrusão agregada e organela dos neurônios através de um processo chamado exofergênese, biologia mal compreendida que é provavelmente relevante para a propagação da patologia da doença neurodegenerativa. Essas abordagens são necessárias para alcançar a pontuação reprodutível de extrudados extrudados extrudados ex-neurônios e demonstrar uma plataforma para a dissecção mecanicista da eliminação do lixo celular via transferência neuronal para células vizinhas. Definir os mecanismos in vivo de como os neurônios ejetam agregados pode realmente influenciar o desenho de novas estratégias para auxiliar no tratamento de condições neurodegenerativas humanas.
Para condições basais, casa C.Elegans da mesma idade biológica a uma temperatura constante de 20 graus Celsius. Para imagens vivas da dinâmica intracelular e características da exoferênese, coloque até 20 animais em uma almofada de ágaros em uma lâmina de microscópio de vidro, e imobilize os animais. Coloque cuidadosamente um deslizamento de cobertura sobre os vermes paralisados e coloque o slide no palco de um microscópio de fluorescência confocal.
Use um objetivo de 10 a 40x para identificar o plano Z desejado em Brightfield, tomando notas do posicionamento do verme, da orientação da cauda da cabeça e da localização da vulva, que são marcos para posterior identificação neuronal e exoferta. Hospedando-se no mesmo plano Z, mude para fluorescência de campo largo visualizando em 10 a 40x para o repórter citosolico escolhido, e role dentro do eixo Z para observar a profundidade do animal e a expressão de fluorescência no plano focal. A cabeça terá um anel nervoso fluorescente, e a cauda mais pontuda conterá uma a duas somas visíveis do neurônio lateral posterior.
Uma ampliação mais alta com uma lente 63x pode ajudar a identificar o anel nervoso, processos neuronais e corpos somados. Primeiro é útil identificar o anel nervoso localizado na cabeça dos processos neuronais animais e laterais. Para isso, comece pela cabeça do verme e role lentamente pelo eixo Z para identificar o plano do anel nervoso onde os processos neuronais estão ligados.
Uma vez identificado o anel nervoso, na visão de fluorescência seguem o processo neuronal anexado lateralmente na direção posterior em direção à vulva, onde a soma será aparente. Uma vez que o corpo ou corpo redondo soma estão em foco, é importante identificar todos os neurônios próximos. Para identificação de neurônios sensíveis ao toque, primeiro encontre a soma ALML, ALMR e AVM, que devem ser os sinais mais brilhantes e marcados por um corpo celular redondo no final do processo.
Uma vez localizada a soma neuronal mais focalada, use a célula AVM, uma célula ventral, para ajudar a atribuir a orientação. Se o neurônio AVM está no mesmo plano que a ALM, então o animal está descansando de lado e o neurônio lateral é o ALMR. Se o neurônio AVM não estiver no mesmo plano que a ALM em questão, o neurônio de toque mais próximo do plano focal é o neurônio ALML.
Também útil é identificar o neurônio PVM, que é um neurônio de toque ventral localizado perto da cauda. O plano focal do PVM indicará se o neurônio de toque anterior é o ALML ou ALMR. Se a ALM em questão está no mesmo plano que o PVM, então o neurônio de toque observado é o neurônio ALML.
Depois que a ALM mais em foco foi identificada e designada, é importante determinar as posições dos outros corpos soma perto da área de interesse e em todos os planos Z, a ponto de não confundi-los com exophers. Uma vez localizado o neurônio de toque de interesse, o ALMR ou ALML, inspecione o neurônio em busca de grandes domínios de exófia saliente, grandes o suficiente para ser considerado uma exoferta de botões, que é pelo menos um quinto do tamanho da soma originária. Se não for observado nenhum domínio bud ou exopher, inspecione ainda mais a soma neuronal para um filamento fino anexado emanando do corpo soma.
Exofers anexados tendem a ser localizados mais perto da soma originária e em um plano Z semelhante. Para identificar uma exofere não acontecido, procure proteínas fluorescentes expelidas concentradas, que muitas vezes são mais brilhantes que a soma. Embora retratado aqui, há uma grande exófia.
Pode haver mais de uma entidade fluorescente originária de uma única soma. Procure por exofers não ligados em diferentes planos focais e na região lateral distante de onde a soma originária foi encontrada. As exóferas normalmente se projetam longe da soma em uma direção posterior do processo neuronal.
Verifique se há objetos esféricos grandes que não estão posicionados e identificados como somas neuronais. Embora os exóferos sejam tipicamente estruturas físicas, elas podem se degradar com o tempo, adquirindo uma forma mais irregular. Procure a presença de eventos noturnos estrelados e, por exemplo, de múltiplos eventos exóferos.
Para evitar confundir e fora do avião soma com um exopher, é fundamental identificar todos os corpos soma próximos, mesmo somas fora de foco no início da observação. Uma soma estendida ou pontiaguda pode ser observada, mas uma extensão sem um local de constrição claro não deve ser pontuada como uma exófia. Rejeite pequenos botões resolvidos que não atinjam um quinto do tamanho da soma na quantificação de eventos exopher.
Embora os neurrites maduros possam se estender dramaticamente com a idade, e as proteínas fluorescentes podem migrar para o fim distal de tais estruturas, não conte os crescimentos neuritas como exófatos. Para identificar entidades fluorescentes que não são exofers, certifique-se de excluir qualquer autofluorescência, que pode ser confundida com detritos vesiculares noturnos estrelados sob fluorescência de campo largo. Para excluir sinais fluorescentes embrionários, alternar entre fluorescência e iluminação de campo brilhante, e verificar a associação do sinal com ovos dentro do útero.
Esta tabela fornece um resumo de diferentes repórteres fluorescentes expressos por neurônios de toque que foram usados para monitorar a produção de exopher. As cargas que são conhecidas por serem extrudadas em exóferos incluem agregados como o Q128, uma fusão de repetições de poliglutamina expandidas por Huntington humanos, lysososomes GFP marcado com proteína de membrana associada lysomal, e mitocôndrias marcadas com GFP localizado em matriz. O GFP citoplasmado não é fortemente expelido, e é preferencialmente retido na soma, embora o GFP possa ser usado para visualizar fracamente exofers.
Em geral, a produção de exópher pelo mCherry expresso em neurônios da ALMR em condições basais começa no primeiro dia da idade adulta e varia de cerca de cinco a 25% das ALMRs examinadas dentro do principal período de tempo de produção exopher do primeiro dia a três adultos. Tensões particulares e perturbações genéticas podem aumentar muito a produção de exóferos dentro dos neurônios ALMR. É crucial localizar todos os neurônios próximos antes de inspecionar o neurônio de interesse e a área circundante para domínios exopher, exophers intactos ou eventos noturnos estrelados.
Quando você está confortável com a identificação manual de exophers, métodos de throughput aprimorados para triagem em larga escala usando imagens de alto conteúdo podem ser empregados, permitindo análise completa do genoma e dissecção de exofergênese mecanicista.
