Este método permite investigar como o estado mitocondrial redox é afetado em condições fisiopatológicas. Também pode ser usado para avaliar a eficácia de estratégias de tratamento que visam proteger mitocôndrias. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite um órgão e uma avaliação específica das mudanças dinâmicas e de rastreamento no estado mitocôndria redox em tempo real.
Este método pode ser combinado com indicadores adicionais para registrar simultaneamente, por exemplo, potencial de membrana mitocondrial ou concentrações de cálcio, além do estado de redox. Este protocolo pode ser aplicado a células culturais, explanações teciduais e culturas de fatias. Comece otimizando as configurações do microscópio confocal de digitalização.
Para isso, ajuste o detector em 12 bits ou 16 bits, ative o modo de varredura sequencial e adicione uma segunda sequência/faixa. Para ambos os canais, selecione uma tabela de pesquisa de cores pseudo que indique pixels acima e subexpostos e, em seguida, selecione um objetivo adequado para o objeto de interesse. Monte uma mancha com células na câmara de imagem.
Adicione um mililitro de tampão de imagem e coloque a câmara no microscópio. Use a ocular e a luz transmitida para concentrar as células. Grave imagens com diferentes formatos de pixels e tamanhos de pinhole.
Em seguida, registos com diferentes intensidades de laser e ajuste o ganho e o limiar do detector. Finalmente, grave imagens com diferentes velocidades de varredura e diferentes números de médias de quadros. Para imagens ao vivo, defina o intervalo timelapse para 30 segundos e duração para 25 minutos.
Em seguida, monte as células, coloque a câmara no microscópio e concentre as células como demonstrado anteriormente. Mude para o modo de digitalização e use o canal de 488 nanômetros na visão ao vivo para se concentrar e localizar as células para imagens. Opcionalmente, para aumentar o número de células gravadas por execução, use a função de vários pontos para visualizar de dois a três campos de exibição por deslizamento de cobertura.
Inicie a aquisição do timelapse e grave cinco imagens como uma gravação de linha de base de dois minutos. Adicione 500 microliters de solução 3X NMDA à câmara para alcançar a concentração final de 30 micromolares e registrar 20 imagens adicionais como uma resposta NMDA de 10 minutos. Em seguida, adicione 500 microliters de solução 4X DA à câmara e grave mais seis imagens.
Aspire o buffer da câmara de imagem e substitua-o por um mililitro de solução DTT. Depois de gravar mais 10 imagens, termine a gravação e salve a série de imagens. Para importar os dados no software de análise de imagens, clique em plugins, selecione formatos bio e, em seguida, importador de bioformitos.
Na caixa de diálogo, escolha hiperstack na pilha de visualizações com, defina o modo de cor como padrão e selecione escala automática. Altere o formato da imagem para 32 bits clicando na imagem, selecionando tipo e, em seguida, a partir das opções, escolha 32 bits. Para dividir os canais de cores em janelas separadas, clique na imagem, vá para a cor e selecione canais divididos.
Ajuste o limiar para selecionar as mitocôndrias para análise clicando na imagem, selecionando ajuste e limiar. Na caixa de diálogo, selecione o fundo escuro vermelho padrão e empilhe histograma. Quando os pixels selecionados aparecerem vermelhos, clique em aplicar.
Em seguida, selecione definir pixels de fundo para processo NAN todas as imagens e execute o mesmo procedimento para o canal dois. Para visualizar a proporção de 405 a 488 nanômetros, crie uma imagem de proporção clicando no processo e na calculadora de imagens. Na caixa de diálogo, selecione o canal um na imagem uma divisão no canal de operação dois na imagem dois.
Em seguida, selecione criar nova janela e processar todas as imagens. Altere a tabela de procuração da imagem de proporção para pseudocoloração clicando na imagem, selecionando tabelas de procuração e, em seguida, disparar. Para analisar a imagem, desenhe ROIs em torno de células individuais ou mitocôndrias na imagem de razão.
Para adicionar os ROIs ao gerenciador de ROI, vá analisar, clique nas ferramentas, selecione gerenciador de ROI, clique em adicionar e selecione mostrar tudo. Para medir as proporções de 405 a 488 nanômetros de células individuais, clique no gerenciador de ROI, selecione todos os ROIs pressionando o Controle A, vá para mais e selecione multi-medidas. Na caixa de diálogo, selecione medir todas as fatias e uma linha por fatia.
Depois de exportar as medições para o software de planilha, selecione a imagem de 405 nanômetros, meça as intensidades de todos os ROIs e exporte novamente as medições para o software de planilha. Da mesma forma, meça as intensidades do ROI da imagem de 488 nanômetros. Para salvar os ROIs para referência futura, selecione todos os ROIs pressionando o Controle A, vá para mais e selecione salvar.
Estes instantâneos representativos de uma gravação timelapse mostram imagens de razão de neurônios antes e depois do tratamento NMDA e após a calibração max/min com DA e DTT. Tratamento dos neurônios com 30 micromolar de NMDA induzidos de oxidação mitocôndrias em poucos minutos. A análise dos canais individuais de fluorescência revelou que a acidose mitocondrial induzida pelo NMDA causou uma queda da fluorescência GFP tanto na excitação de 405 quanto 488 nanômetros.
Em um experimento de controle, o tratamento com da da impediu qualquer oxidação de mitocôndrias adicional pela NMDA. E, portanto, a proporção de 405 a 488 não mudou, apesar de uma considerável saciamento da intensidade de fluorescência GFP2 sensível ao redox. Este experimento confirmou que a razão de 405 a 488 nanômetros não é afetada por alterações de pH.
Em um experimento separado, o potencial da membrana mitocondrial, o estado redox e a morfologia foram avaliados em paralelo. O tratamento dos neurônios com 60 MMDA micromolar resultou na perda de tetrametilemi ou sinal TMRE e um aumento na razão de 405 a 488 nanômetros rho GFP seguido por algum arredondamento atrasado de mitocôndrias. Quando você começa a usar este método, é muito importante ter tempo para otimizar cuidadosamente as configurações microscópicas.
Isso ajudará a manter os neurônios saudáveis durante seus experimentos. Também é muito importante respeitar sempre as regras de segurança a laser. Certifique-se de não ser exposto à radiação laser quando estiver adicionando drogas para adulterar durante gravações ao vivo.
