Este fluxo de trabalho automatizado fornece uma digestão enzimática proteica consistente com excelente reprodutibilidade e throughput. Isso melhora a precisão e a confiabilidade da descoberta, validação e aplicação clínica do biomarcador por espectrometria de massa. A vantagem dessa tecnologia é que todo o fluxo de trabalho pode ser concluído para 96 amostras em aproximadamente cinco horas com intra-ensaio e cv de ensaio inter-ensaio inferior a 20% para a maioria das proteínas.
Esta preparação precisa de amostras de alto rendimento nos permite investigar doenças proteomas de tecido ou biofluidos em uma escala maior. Além disso, o fluxo de trabalho automatizado de preparação de amostras proteômicas fornece uma base sólida para alto conteúdo e uma análise proteômica quantitativa. Demonstrando o procedimento estarão o Dr.Qin Fu, Diretor do Centro de Altos Rendimentos do Cedar Sinai e o Sr. Casey Johnson, um pesquisador associado do meu laboratório.
Antes de iniciar a análise, adicione cinco microliters de plasma humano saudável em uma placa de propileno de 96 balas. Quando todas as amostras tiverem sido carregadas, abra o software do dispositivo de manipuladora de líquido e sob a guia do método, selecione em casa todos os eixos para orientar o manipulador líquido automatizado. Confirme que todas as seringas da estação de trabalho não contêm bolhas de ar visíveis e abram um novo método e clique em Executar para iniciar o método.
Digite verdadeiro no enter um valor a ser usado para solicitar o autosampler para ter uma placa autosampler preparada no final do método e clique em OK. Digite um no enterr um valor a ser usado para o prompt da primeira coluna e clique em OK. Digite 12 no digite um valor a ser usado para o prompt da última coluna e clique em OK. Se uma placa de amostra estiver sendo usada com volumes amostrais de pelo menos 20 microliters, digite verdadeiro no digite um valor a ser usado para o prompt da placa de amostra e clique em OK. Siga as instruções na janela Configuração do Labware Guiado e clique em Continuar. Carregue os reagentes apropriados nos poços apropriados e clique em Next. Clique novamente no Next para definir o deck automático do manipulador líquido como ilustrado, incluindo as placas de reagente, reação, amostra e autosampler, caixas de ponta de 90 microliter de seis poços, uma caixa de ponta vazia de 90 microliter e uma caixa de ponta de 230 microliter completa.
Em seguida, clique em Concluir para iniciar o método. No prompt de continuação após centrifugação, recupere a placa de reação e coloque a placa na centrífuga. No final da centrifugação, retorne a placa de reação à sua posição dentro do manipulador líquido automatizado e clique em Continuar.
Para a cromatografia líquida e a análise da espectrometria de massa tandem, resolva os peptídeos em uma coluna C18 2.1 por 100 milímetros de 3,5 micrômetros por cromatografia líquida de alta pressão com uma taxa de fluxo de 250 microliters por minuto e analisada em linha em um espectrômetro de massa quádrupla triplo. Cinco minutos após o carregamento, equilibre a coluna com solução B de 5% tampão e elute os peptídeos com um gradiente linear de 5-35% de tampão B ao longo de 30 minutos. No final da eluição, lave a coluna com 98% de tampão B por 10 minutos seguido de uma lavagem de cinco minutos com 5% de tampão B antes de carregar a próxima amostra.
Para o desvio on-line, use uma válvula de comutação em duas fases para desviar o eluente pós-coluna para resíduos antes de entrar na fonte de íons. Quando todas as amostras foram elucidadas, vários dados de monitoramento de reação podem ser processados. Nesta análise representativa, três peptídeos beta-gal e dois peptídeos de albumina foram monitorados a partir de proteínas beta-gal e plasma processado.
A precisão do fluxo de trabalho de preparação automatizada da amostra foi calculada como a porcentagem do coeficiente de variância do fluxo de trabalho de monitoramento de reação selecionado proteômico total menos o coeficiente percentual de variância da espectrometria de massa da cromatografia líquida tandem. Como esperado, foram observadas boas intensidades de sinal tanto para a albumina de soro humano quanto para as proteínas beta-gal. Para monitorar a precisão das etapas de transferência de líquido, padrões de peptídeos marcados por isótopos estáveis podem ser cravados para a albumina de soro humano endógeno e proteína beta-gal exógena em etapas independentes de transferência de reagentes.
Para validar o fluxo de trabalho automatizado de preparação da amostra proteômica, o coeficiente intradiário de valores de variância foi calculado a partir de 21 poços preparados no mesmo dia. O coeficiente percentual médio intradia de variância para 40 proteínas variou de 4 a 20% Para avaliar o efeito de borda do fluxo de trabalho automatizado baseado em placas, o coeficiente percentual de variância pode ser calculado a partir de poços específicos dentro de colunas e linhas designadas. Neste experimento representativo, as intensidades de sinal de monitoramento de múltiplas reações foram semelhantes em todas as configurações de coluna e linha com o coeficiente percentual de variância variando de 3 a 22%Os passos mais importantes são adicionar uma amostra corretamente de acordo com o mapa de placas desejada de 96 poços e configurar corretamente a placa de reagente de acordo com a instrução do software.
Este método automatizado de preparação de amostras proteômicas permite que os pesquisadores coletem dados de proteômica confiável e quantitativa em larga escala.
