Bu protokol önemlidir, çünkü normalde hiç olmayan Drosophila'da yetişkin nörogenezlerini tetikleyen merkezi bir beyin hasarı yöntemi göstermektedir. Erişkin nörogenezinin altında kalan moleküler mekanizmaları anlamak için bu tekniğin kullanılmasının insan nöral yenilenmesi ile ilgili olacağını öngörüyoruz. Bu tekniği öğrenmek sabır ve azim gerektirir.
Analiz için beyin toplamadan önce birkaç hafta boyunca günde beş ila 10 beyin üzerinde pratik yapmanızı öneririz. Sinekleri karbondioksit pedinde uyuşturuktan sonra. Yeni eklenen F1 genç erkek sineklerini eklosyondan sonraki altı saat içinde sıralayın ve şişe başına 40 veya daha az sinek içeren yiyecekleri içeren temiz şişelere yerleştirin.
Bölünen hücreleri EdU ile etiketlemeyi planlıyorsanız, %10 sakkarozda 50 değirmen veya daha fazla EdU'dan oluşan 200 mikrolitre hazırlayın ve hazırlanan çözeltiyi boş bir şişeye 23 milimetre yuvarlak sınıf üç filtre kağıdına yerleştirin, ardından yaralanmadan altı saat önce ön besleme için erkek sinekleri şişeye yerleştirin. Daha sonra, beş dakika boyunca% 70 etanol ile doldurulmuş 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne yaklaşık 100 pim yerleştirerek Minutien Pimlerini sterilize edin. Daha sonra% 70 etanol püskürterek ve temiz tüy bırakmayan bir doku ile kuru silerek karbondioksit pedini ve boya fırçasını sterilize edin.
Aletler temiz ve kuru olduktan sonra, 40 veya daha az sıralanmış F1 erkeğini temiz ped üzerine aktarın ve iki gruba ayırın. Bir grup, kontrol yaralanmamış sinekler olarak hizmet edecek. Ve ikinci deney grubu travmatik beyin hasarına maruz kalacak.
Daha sonra, toparlama kullanarak mikro santrifüj tüpünden dört ila beş yeni Minutien pimini çekin ve karbondioksit yastığının kenarına yerleştirin. Daha sonra diseksiyon kapsamı altında keskin bir noktaya sahip düz bir Minutien pimi seçin. Keskin pimleri yeniden takın ve hasarlı veya künt pimleri güvenli bir şekilde bertaraf etmek için% 70 etanol içeren ayrı bir tüpe yerleştirin.
Daha sonra, stereo mikroskop LED lambası üzerindeki standart çapraz genotip anahtarına sahip sinekler için, 440 ila 460 nanometrede eksitasyona izin veren ve 500 ila 560 nanometrede görselleştirmeye izin veren yeşil floresan proteini için uygun eksitasyon ve emisyon filtreleri ile donatılmıştır. Daha sonra deneysel grubu bir sinek seçin ve sineği, deneycinin sineklerin başı sağa doğru olan kafa kapsülünün dorsal bir görünümüne sahip olacak şekilde konumlandırın. Toparlapları kullanmak seçili Minutien pimini bir elinde, boya fırçasını diğer elinde tutup tutar.
Daha sonra fırçayı sırt toraksının ön kısmına yerleştirin ve sineği stabilize etmek için hafifçe aşağı itin. Minutien piminin ucunu başın sağ tarafındaki mantar gövdeleri hücre gövdelerini hedefleyin ve kafa kapsülüne nüfuz edin. Yer işaretleri kullanarak ocelli ve gözün dorsal kenarı arasındaki sırt başı pikselini hedef alıyorsanız.
Yaralanmayı tamamladıktan sonra, kafayı Minutien piminin dışına hafifçe itmek için boya fırçasını kullanın. Beyni RNA dizilimi veya QRT PCR için kullanmak başın sol tarafında ikinci bir yaralanmaya neden oluyorsa. Tüm deneysel sinekler yaralandıktan sonra kontrolü yerleştirin ve yaralı sinekleri yiyecek içeren ayrı etiketli şişelere yerleştirin.
Sineklerin yiyeceğe yakalanmasını önlemek için şişeleri yatay olarak döşeyin. Standart haç sineklerini 25 santigrat dereceye yerleştirin ve permatwin 30 santigrat derecede uçarak yaşlanıyor. 24 saatten uzun yaşlanırsa, sinekleri her bir ila iki günde bir temiz yiyeceklere aktarın.
Aktif olarak mitoz geçiren hücreler için anti pH3 bir belirteç kullanılarak yaralanma sonrası 24 saat boyunca çoğalmada önemli bir artış gözlendi. Kontrol merkezi beyinlerinin her birinde yaklaşık üç pH3 pozitif hücre gözlenir. Ve yaralı merkezi beyinlerin her birinde 11 pH3 pozitif hücre.
Yedi gün içinde, kontrol hücresi beyinlerinin her birinde ortalama iki EdU pozitif hücre bulunur. Ve yaralı merkezi beyinlerin her birinde 11 EdU pozitif hücre, bu da pH3 antikoru ile yaralanma sonrası 24 saat elde edilen sonuçlara benzer. 14 günde kontroller merkezi beyin başına ortalama bir EdU pozitif hücre ve yaralı beyinler merkezi beyin başına ortalama 29 EdU pozitif hücre ortalamasına sahip oldu.
Hücre çoğalmasının en azından travmatik beyin hasarının ardından ikinci haftaya kadar devam ettiğini göstermek. Merkezi beyindeki en güçlü proliferatif yanıt, beyinler eklozyondan sonraki ilk 24 saat içinde yaralandığında gözlenir. Yedi gün sonra, delici bir yaralanma hala çoğalmada önemli bir artışa neden olur.
Bununla birlikte, 14 gün boyunca, hücrelerin bölünme yeteneği beyin başına bir bölme hücresine önemli ölçüde azalır. Kontrol beyinlerine benzer. Permatwin etiketleme sistemi kullanılarak, iki günde, iki haftada, kontrollere kıyasla yaralı örneklerde daha fazla permatwin klonu tespit edildi.
Yaralanmadan sonra klonların sayısı zamanla artar. Yaralanmadan iki hafta sonra yaralı beyinlerin %50'sinde yeni mantar vücut nöronları vardı. Bu yeni nöronlar dendritlerini yaklaşık olarak mantar gövdesi kaliksine ve aksonları mantar vücut loblarına yansıttılar.
Beynin yenilenme gösteren diğer bölgeleri arasında elipsoid vücut Anten lobları ve lateral boynuz bulunur. Beyin yaralanmalarını yaparken keskin bir Minutien pimi kullandığınızdan emin olun, çünkü donuk veya bükülmüş bir pim kullanımı mortaliteyi artıracaktır. Ayrıca, boya fırçası ile sinekleri çok fazla zorlamamaya dikkat edin, çünkü bu da mortaliteyi artıracaktır.
Bu prosedürden sonra, immünöritokimya kendi kendine çoğalma ölçmek ve ayrıca yeni nöronları ve gliaları tanımlamak için kullanılabilir.
