Questo protocollo è significativo perché dimostra un metodo di lesione cerebrale centrale che innesca la neurogenesi adulta in Drosophila, dove normalmente non ce n'è. Prevediamo che l'uso di questa tecnica per comprendere i meccanismi molecolari alla base della neurogenesi adulta sarà rilevante per la rigenerazione neurale umana. Imparare questa tecnica richiede pazienza e perseveranza.
Si consiglia di praticare da cinque a 10 cervelli al giorno per diverse settimane prima di raccogliere cervelli per l'analisi. Dopo aver anestetizzato le mosche su un cuscinetto di anidride carbonica. Ordina le mosche giovani maschiO F1 appena chiuse entro sei ore dall'eclosione e mettile in fiale pulite contenenti cibo con 40 o meno mosche per fiala.
Se si prevede di etichettare le cellule divisorie con EdU preparare 200 microlitri da 50 mill o più edU in 10% di saccarosio e posizionare la soluzione preparata su una carta da filtro rotonda di 23 millimetri di grado tre in una fiala vuota, quindi posizionare le mosche maschio nel flaconcino per la prealimentazione sei ore prima della lesione. Successivamente, disinfettare i perni Minutien posizionando circa 100 pin in un tubo micro centrifuga da 1,5 millilitri riempito con etanolo al 70% per cinque minuti. Quindi disinfettare il tampone di anidride carbonica e il pennello spruzzando il 70% di etanolo e asciugando con un tessuto pulito privo di lanugine.
Una volta che gli strumenti sono puliti e asciutti, trasferire 40 o meno maschi F1 ordinati sul pad pulito e separarli in due gruppi. Un gruppo servirà come controllo delle mosche illese. E il secondo gruppo sperimentale sarà sottoposto a lesioni cerebrali traumatiche penetranti.
Successivamente, utilizzando una pinza estrarre da quattro a cinque nuovi perni Minutien dal tubo della micro centrifuga e posizionarli vicino al bordo del cuscinetto di anidride carbonica. Quindi sotto l'ambito di dissezione scegliere un perno Minutien dritto con una punta affilata. Riutilizzare i perni affilati e posizionare i perni danneggiati o smussati in un tubo separato contenente il 70% di etanolo per uno smaltimento sicuro.
Successivamente, per le mosche con l'interruttore standard a genotipo incrociato sulla lampada a LED stereomicroscopica dotata degli appositi filtri di eccitazione ed emissione per la proteina di fluorescenza verde che consente l'eccitazione a 440-460 nanometri e consente la visualizzazione a 500-560 nanometri. Quindi scegli una mosca il gruppo sperimentale e posiziona la mosca in modo tale che lo sperimentatore abbia una vista dorsale della capsula della testa con la testa delle mosche a destra. Usando la pinza prendi e tieni il perno Minutien selezionato in una mano e il pennello nell'altra mano.
Quindi posizionare il pennello sulla parte anteriore del torace dorsale e spingere delicatamente verso il basso per stabilizzare la mosca. Punta la punta del perno Minutien verso i corpi cellulari dei corpi dei funghi sul lato destro della testa e penetra nella capsula della testa. Se si utilizzano punti di riferimento, la cuticola della testa dorsale tra gli ocelli e il bordo dorsale dell'occhio.
Dopo aver completato l'infortunio, utilizzare il pennello per spingere delicatamente la testa fuori dal perno Minutien. Se si utilizza il cervello per il sequenziamento dell'RNA o la PCR QRT ci fanno una seconda lesione sul lato sinistro della testa. Una volta che tutte le mosche sperimentali sono state ferite, posizionare il controllo e le mosche ferite in fiale etichettate separate contenenti cibo.
Posare le fiale orizzontalmente per evitare che le mosche rimangano intrappolate nel cibo. Posiziona le mosche incrociate standard a 25 gradi Celsius e le mosche permatwin a 30 gradi Celsius fino all'età. Se invecchiamento superiore a 24 ore trasferire le mosche su cibo pulito ogni uno o due giorni.
Un aumento significativo della proliferazione è stato osservato 24 ore dopo l'infortunio utilizzando anti pH3 un marker per le cellule attivamente sottoposte a mitosi. Circa tre cellule pH3 positive sono osservate in ciascuno dei cervelli centrali di controllo. E 11 cellule pH3 positive in ciascuno dei cervelli centrali danneggiati.
Entro sette giorni, una media di due cellule Positive EdU sono presenti in ciascuno dei cervelli delle cellule di controllo. E 11 cellule EdU positive in ciascuno dei cervelli centrali feriti, che è simile ai risultati ottenuti 24 ore dopo l'infortunio con l'anticorpo pH3. A 14 giorni i controlli hanno registrato una media di una cellula EdU positiva per cervello centrale e i cervelli feriti hanno registrato una media di 29 cellule EdU positive per cervello centrale.
Dimostrando che la proliferazione cellulare continua almeno nella seconda settimana dopo una lesione cerebrale traumatica penetrante. La risposta proliferativa più forte nel cervello centrale si osserva quando i cervelli sono feriti entro le prime 24 ore dopo l'eclosione. Entro sette giorni dopo la chiusura una lesione penetrante provoca ancora un aumento significativo della proliferazione.
Tuttavia, entro 14 giorni, la capacità delle cellule di dividersi diminuisce significativamente a una cellula in divisione per cervello. Che è simile a quello dei cervelli di controllo. Utilizzando il sistema di etichettatura di permatwin sono stati rilevati più cloni di permatwin nei campioni feriti a due giorni, in due settimane, rispetto ai controlli.
Con il numero di cloni che aumenta nel tempo a seguito di lesioni. Due settimane dopo l'infortunio c'erano nuovi neuroni del corpo dei funghi nel 50% dei cervelli feriti. Questi nuovi neuroni hanno proiettato i loro dendriti approssimativamente al calice del corpo del fungo e gli assoni ai lobi del corpo del fungo.
Altre aree del cervello che sembravano rigenerarsi includono i lobi antennali del corpo ellissoide e il corno laterale. Assicurati di usare un perno Minutien affilato quando fai le lesioni cerebrali poiché l'uso di un perno opaco o piegato aumenterà la mortalità. Assicurati anche di non spingere troppo forte sulle mosche con il pennello in quanto ciò aumenterà anche la mortalità.
Seguendo questa procedura, l'immunoistochimica può essere utilizzata per quantificare l'autoproliferazione e anche per identificare nuovi neuroni e glia.
