Ce protocole est important car il démontre une méthode de lésion cérébrale centrale qui déclenche la neurogenèse adulte chez la drosophile, là où il n’y en a normalement pas. Nous prévoyons que l’utilisation de cette technique pour comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à la neurogenèse adulte sera pertinente pour la régénération neuronale humaine. Apprendre cette technique demande de la patience et de la persévérance.
Nous recommandons de pratiquer sur cinq à 10 cerveaux par jour pendant plusieurs semaines avant de collecter des cerveaux pour analyse. Après anesthésie des mouches sur un tampon de dioxyde de carbone. Triez les jeunes mouches mâles F1 nouvellement écloses dans les six heures suivant l’eclosion et placez-les dans des flacons propres contenant de la nourriture avec 40 mouches ou moins par flacon.
Si vous envisagez d’étiqueter des cellules en division avec de l’EdU, préparez 200 microlitres de 50 mill ou plus d’EdU dans du saccharose à 10% et placez la solution préparée sur un papier filtre rond de 23 millimètres de grade trois dans un flacon vide, puis placez les mouches mâles dans le flacon pour la pré-alimentation six heures avant la blessure. Ensuite, désinfectez les broches Minutien en plaçant environ 100 broches dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre rempli d’éthanol à 70% pendant cinq minutes. Ensuite, désinfectez le tampon de dioxyde de carbone et le pinceau en pulvérisant de l’éthanol à 70% et en essuyant avec un tissu propre non pelucheux.
Une fois que les outils sont propres et secs, transférez 40 mâles F1 triés ou moins sur le tampon propre et séparez-les en deux groupes. Un groupe servira de contrôle aux mouches non blessées. Et le deuxième groupe expérimental sera soumis à une lésion cérébrale traumatique pénétrante.
Ensuite, à l’aide de pinces, tirez quatre à cinq nouvelles broches Minutien du tube de microcentrifugation et placez-les près du bord du tampon de dioxyde de carbone. Ensuite, sous la lunette de dissection, choisissez une broche Minutien droite avec une pointe pointue. Réutilisez les broches pointues et placez les broches endommagées ou émoussées dans un tube séparé contenant 70 % d’éthanol pour une élimination en toute sécurité.
Ensuite, pour les mouches avec l’interrupteur de génotype croisé standard sur la lampe LED de stéréomicroscope équipée des filtres d’excitation et d’émission appropriés pour la protéine de fluorescence verte qui permet une excitation à 440 à 460 nanomètres et permet la visualisation à 500 à 560 nanomètres. Ensuite, choisissez une mouche dans le groupe expérimental et positionnez la mouche de manière à ce que l’expérimentateur ait une vue dorsale de la capsule de tête avec la tête des mouches à droite. À l’aide de pinces, ramassez et tenez l’épingle Minutien sélectionnée dans une main et le pinceau dans l’autre main.
Ensuite, placez la brosse sur l’antérieure du thorax dorsal et poussez doucement vers le bas pour stabiliser la mouche. Dirigez la pointe de l’épingle Minutien vers les corps cellulaires des corps de champignons sur le côté droit de la tête et pénétrez dans la capsule de tête. Si vous utilisez des repères, ciblez la cuticule de la tête dorsale entre les ocelles et le bord dorsal de l’œil.
Après avoir terminé la blessure, utilisez le pinceau pour pousser doucement la tête hors de l’épingle Minutien. Si vous utilisez le cerveau pour le séquençage de l’ARN ou la PCR QRT, nous nous faisons subir une deuxième blessure sur le côté gauche de la tête. Une fois que toutes les mouches expérimentales ont été blessées, placez le témoin et les mouches blessées dans des flacons étiquetés séparés contenant de la nourriture.
Posez les flacons horizontalement pour empêcher les mouches de se coincer dans la nourriture. Placez les mouches croisées standard à 25 degrés Celsius et les mouches permatwin à 30 degrés Celsius pour vieillir. Si vous vieillissez plus de 24 heures, transférez les mouches sur des aliments propres tous les un à deux jours.
Une augmentation significative de la prolifération a été observée 24 heures après la blessure en utilisant l’anti pH3, un marqueur pour les cellules subissant activement une mitose. Environ trois cellules pH3 positives sont observées dans chacun des cerveaux centraux témoins. Et 11 cellules pH3 positives dans chacun des cerveaux centraux blessés.
En sept jours, une moyenne de deux cellules EdU positives sont présentes dans chacun des cerveaux des cellules témoins. Et 11 cellules EdU positives dans chacun des cerveaux centraux blessés, ce qui est similaire aux résultats obtenus 24 heures après la blessure avec l’anticorps pH3. À 14 jours, les témoins avaient en moyenne une cellule EdU positive par cerveau central, et les cerveaux blessés avaient en moyenne 29 cellules EdU positives par cerveau central.
Démontrer que la prolifération cellulaire se poursuit au moins jusqu’à la deuxième semaine suivant une lésion cérébrale traumatique pénétrante. La réponse proliférative la plus forte dans le cerveau central est observée lorsque les cerveaux sont blessés dans les 24 premières heures après l’éclosion. Sept jours après l’eclosion, une blessure pénétrante provoque toujours une augmentation significative de la prolifération.
Cependant, à 14 jours, la capacité des cellules à se diviser diminue considérablement à une cellule en division par cerveau. Ce qui est similaire à celui des cerveaux de contrôle. En utilisant le système de marquage permatwin, plus de clones permatwin ont été détectés dans des échantillons blessés à deux jours, en deux semaines, par rapport aux témoins.
Avec le nombre de clones augmentant au fil du temps après une blessure. Deux semaines après la blessure, il y avait de nouveaux neurones du corps des champignons dans 50% des cerveaux blessés. Ces nouveaux neurones ont projeté leurs dendrites approximativement vers le calice du corps du champignon et les axones vers les lobes du corps du champignon.
D’autres zones du cerveau qui semblaient se régénérer comprennent les lobes d’antenne du corps ellipsoïde et la corne latérale. Assurez-vous d’utiliser une épingle Minutien pointue lorsque vous faites des lésions cérébrales, car l’utilisation d’une épingle terne ou pliée augmentera la mortalité. Assurez-vous également de ne pas pousser trop fort sur les mouches avec le pinceau car cela augmentera également la mortalité.
Suite à cette procédure, l’immunohistochimie peut être utilisée pour quantifier l’auto-prolifération et aussi pour identifier de nouveaux neurones et glie.
