Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es eine zentrale Hirnverletzungsmethode demonstriert, die die Neurogenese bei Erwachsenen in Drosophila auslöst, wo es normalerweise keine gibt. Wir gehen davon aus, dass die Verwendung dieser Technik zum Verständnis der molekularen Mechanismen, die der adulten Neurogenese zugrunde liegen, für die neuronale Regeneration des Menschen relevant sein wird. Das Erlernen dieser Technik erfordert Geduld und Ausdauer.
Wir empfehlen, mehrere Wochen lang täglich an fünf bis 10 Gehirnen zu üben, bevor Gehirne zur Analyse gesammelt werden. Nach der Betäubung der Fliegen auf einem Kohlendioxidpad. Sortieren Sie neu ausgeschiedene junge F1-Fliegen innerhalb von sechs Stunden nach der Entnahme und legen Sie sie in saubere Fläschchen mit Nahrung mit 40 oder weniger Fliegen pro Durchstechflasche.
Wenn Sie planen, Teilungszellen mit EdU zu beschriften, bereiten Sie 200 Mikroliter à 50 Mill oder mehr EdU in 10% Saccharose vor und legen Sie die vorbereitete Lösung sechs Stunden vor der Verletzung auf ein rundes Filterpapier der Sorte 23 Millimeter drei Klasse, dann legen Sie die männlichen Fliegen sechs Stunden vor der Verletzung in die Durchstechflasche. Als nächstes desinfizieren Sie Minutien Pins, indem Sie etwa 100 Pins für fünf Minuten in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen legen, das mit 70% Ethanol gefüllt ist. Desinfizieren Sie dann das Kohlendioxidpad und den Pinsel, indem Sie 70% Ethanol sprühen und mit einem sauberen fusselfreien Gewebe trocken wischen.
Sobald die Werkzeuge sauber und trocken sind, übertragen Sie 40 oder weniger sortierte F1-Männchen auf das saubere Pad und trennen Sie sie in zwei Gruppen. Eine Gruppe dient als Kontrolle unverletzter Fliegen. Und die zweite experimentelle Gruppe wird einem penetrierenden Schädel-Hirn-Trauma ausgesetzt sein.
Als nächstes ziehen Sie mit einer Pinzette vier bis fünf neue Minutien-Stifte aus dem Mikrozentrifugenrohr und platzieren Sie sie in der Nähe des Randes des Kohlendioxidpads. Wählen Sie dann unter dem Sezierbereich einen geraden Minutien-Stift mit einer scharfen Spitze. Verwenden Sie scharfe Stifte wieder und legen Sie beschädigte oder stumpfe Stifte in ein separates Röhrchen, das 70% Ethanol enthält, um eine sichere Entsorgung zu gewährleisten.
Als nächstes für Fliegen mit dem Standard-Kreuzgenotyp-Schalter an der Stereomikroskop-LED-Lampe, die mit den entsprechenden Anregungs- und Emissionsfiltern für das grüne Fluoreszenzprotein ausgestattet ist, das eine Anregung bei 440 bis 460 Nanometern ermöglicht und eine Visualisierung bei 500 bis 560 Nanometern ermöglicht. Wählen Sie dann eine Fliege der experimentellen Gruppe und positionieren Sie die Fliege so, dass der Experimentator eine dorsale Ansicht der Kopfkapsel mit dem Fliegenkopf nach rechts hat. Mit einer Pinzette nehmen Sie den ausgewählten Minutien-Stift in der einen Hand und den Pinsel in der anderen Hand auf und halten Sie ihn.
Legen Sie dann die Bürste auf das Vorderteil des dorsalen Thorax und drücken Sie sie sanft nach unten, um die Fliege zu stabilisieren. Richten Sie die Spitze des Minutien-Stiftes auf die Zellkörper des Pilzkörpers auf der rechten Seite des Kopfes und dringen Sie in die Kopfkapsel ein. Wenn Sie Landmarken verwenden, zielen Sie auf die dorsale Kopfkutikula zwischen den Ocelli und dem dorsalen Rand des Auges.
Nachdem Sie die Verletzung abgeschlossen haben, verwenden Sie den Pinsel, um den Kopf sanft vom Minutien-Stift zu drücken. Wenn wir das Gehirn für die RNA-Sequenzierung oder QRT-PCR verwenden, machen wir eine zweite Verletzung auf der linken Seite des Kopfes. Sobald alle Versuchsfliegen verletzt wurden, legen Sie die Kontroll- und verletzten Fliegen in separat gekennzeichnete Fläschchen mit Nahrung.
Legen Sie die Fläschchen horizontal, um zu verhindern, dass sich Fliegen in der Nahrung verfangen. Platzieren Sie die Standard-Kreuzfliegen bei 25 Grad Celsius und Permatwin-Fliegen bei 30 Grad Celsius, um zu altern. Wenn Sie länger als 24 Stunden altern, übertragen Sie die Fliegen alle ein bis zwei Tage auf saubere Nahrung.
Ein signifikanter Anstieg der Proliferation wurde 24 Stunden nach der Verletzung unter Verwendung von Anti-pH3-Marker für Zellen beobachtet, die sich aktiv einer Mitose unterziehen. Ungefähr drei pH3-positive Zellen werden in jedem der zentralen Kontrollgehirne beobachtet. Und 11 pH3-positive Zellen in jedem der verletzten Zentralhirne.
Nach sieben Tagen sind durchschnittlich zwei EdU-positive Zellen in jedem der Kontrollzellgehirne vorhanden. Und 11 EdU-positive Zellen in jedem der verletzten Zentralhirne, was den Ergebnissen ähnelt, die 24 Stunden nach der Verletzung mit pH3-Antikörpern erzielt wurden. Nach 14 Tagen hatten die Kontrollen durchschnittlich eine EdU-positive Zelle pro zentralem Gehirn, und verletzte Gehirne durchschnittlich 29 EdU-positive Zellen pro zentralem Gehirn.
Es wird gezeigt, dass die Zellproliferation nach einer durchdringenden traumatischen Hirnverletzung mindestens in der zweiten Woche anhält. Die stärkste proliferative Reaktion im zentralen Gehirn wird beobachtet, wenn Gehirne innerhalb der ersten 24 Stunden nach der Eklosion verletzt werden. Sieben Tage nach der Eklosion verursacht eine penetrierende Verletzung immer noch einen signifikanten Anstieg der Proliferation.
Mit 14 Tagen nimmt die Fähigkeit der Zellen, sich zu teilen, jedoch signifikant auf eine sich teilende Zelle pro Gehirn ab. Das ist ähnlich wie bei Kontrollgehirnen. Mit dem permatwin-Markierungssystem wurden in verletzten Proben nach zwei Tagen in zwei Wochen mehr Permatwin-Klone nachgewiesen als in Kontrollen.
Die Anzahl der Klone nimmt im Laufe der Zeit nach einer Verletzung zu. Zwei Wochen nach der Verletzung gab es in 50% der verletzten Gehirne neue Pilzkörperneuronen. Diese neuen Neuronen projizierten ihre Dendriten ungefähr auf den Pilzkörperkelch und Axone auf die Pilzkörperlappen.
Andere Bereiche des Gehirns, die sich zu regenerieren schienen, sind die Antennenlappen des Ellipsoidkörpers und das laterale Horn. Achten Sie darauf, einen scharfen Minutien-Pin zu verwenden, wenn Sie die Hirnverletzungen durchführen, da die Verwendung eines stumpfen oder gebogenen Stifts die Mortalität erhöht. Achten Sie auch darauf, nicht zu stark mit dem Pinsel auf die Fliegen zu drücken, da dies auch die Sterblichkeit erhöht.
Nach diesem Verfahren kann die Immunhistochemie verwendet werden, um die Selbstproliferation zu quantifizieren und auch neue Neuronen und Gliazellen zu identifizieren.
