Este protocolo es significativo porque demuestra un método de lesión cerebral central que desencadena la neurogénesis adulta en Drosophila, donde normalmente no hay ninguna. Anticipamos que el uso de esta técnica para comprender los mecanismos moleculares subyacentes a la neurogénesis adulta será relevante para la regeneración neuronal humana. Aprender esta técnica requiere paciencia y perseverancia.
Recomendamos practicar en cinco a 10 cerebros diariamente durante varias semanas antes de recolectar cerebros para su análisis. Después de anestesiar las moscas en una almohadilla de dióxido de carbono. Clasifique las moscas macho jóvenes F1 recién eclosionadas dentro de las seis horas posteriores a la eclosión y colóquelas en viales limpios que contengan alimentos con 40 o menos moscas por vial.
Si planea etiquetar las células en división con EdU, prepare 200 microlitros de 50 mill o más de EdU en sacarosa al 10% y coloque la solución preparada en un papel de filtro de grado tres redondo de 23 milímetros en un vial vacío, luego coloque las moscas macho en el vial para la prealimentación seis horas antes de la lesión. A continuación, desinfecte minutien Pins colocando aproximadamente 100 pines en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros lleno de etanol al 70% durante cinco minutos. Luego desinfecte la almohadilla de dióxido de carbono y el pincel rociando etanol al 70% y limpiándolo con un pañuelo limpio y sin pelusa.
Una vez que las herramientas estén limpias y secas, transfiera 40 o menos machos F1 clasificados a la almohadilla limpia y sepárelos en dos grupos. Un grupo servirá como el control de las moscas ilesas. Y el segundo grupo experimental será sometido a una lesión cerebral traumática penetrante.
A continuación, con pinzas, saque de cuatro a cinco nuevos pines Minutien del tubo de la micro centrífuga y colóquelos cerca del borde de la almohadilla de dióxido de carbono. Luego, debajo del endoscopio de disección, elija un pasador Minutien recto con un punto afilado. Reutilice los pasadores afilados y coloque los pasadores dañados o romos en un tubo separado que contenga 70% de etanol para una eliminación segura.
A continuación, para las moscas con el interruptor de genotipo cruzado estándar en la lámpara LED del microscopio estereoscópico equipada con los filtros de excitación y emisión apropiados para la proteína de fluorescencia verde que permite la excitación a 440 a 460 nanómetros y permite la visualización a 500 a 560 nanómetros. Luego elija una mosca del grupo experimental y coloque la mosca de tal manera que el experimentador tenga una vista dorsal de la cápsula de la cabeza con la cabeza de las moscas a la derecha. Usando fórceps, levante y sostenga el pasador Minutien seleccionado en una mano y el pincel en la otra mano.
Luego coloque el cepillo en la parte anterior del tórax dorsal y empuje suavemente hacia abajo para estabilizar la mosca. Apunte la punta del alfiler Minutien a los cuerpos celulares de los cuerpos de hongos en el lado derecho de la cabeza y penetre la cápsula de la cabeza. Si se usan puntos de referencia, diríjase a la cutícula dorsal de la cabeza entre los ocelos y el borde dorsal del ojo.
Después de completar la lesión, use el pincel para empujar la cabeza suavemente fuera del pasador Minutien. Si utilizamos el cerebro para la secuenciación del ARN o la PCR QRT nos provocan una segunda lesión en el lado izquierdo de la cabeza. Una vez que todas las moscas experimentales han sido lesionadas, coloque las moscas de control y lesionadas en viales etiquetados separados que contengan alimentos.
Coloque los viales horizontalmente para evitar que las moscas queden atrapadas en la comida. Coloque las moscas cruzadas estándar a 25 grados Celsius y las moscas permatwin a 30 grados Celsius para envejecer. Si envejece más de 24 horas, transfiera las moscas a los alimentos limpios cada uno o dos días.
Se observó un aumento significativo en la proliferación 24 horas después de la lesión utilizando anti pH3, un marcador para las células que experimentan mitosis activamente. Se observan aproximadamente tres células positivas de pH3 en cada uno de los cerebros centrales de control. Y 11 células pH3 positivas en cada uno de los cerebros centrales lesionados.
A los siete días, un promedio de dos células positivas de EdU están presentes en cada uno de los cerebros de las células de control. Y 11 células EdU positivas en cada uno de los cerebros centrales lesionados, lo que es similar a los resultados obtenidos 24 horas después de la lesión con anticuerpos pH3. A los 14 días, los controles promediaron una célula EdU positiva por cerebro central, y los cerebros lesionados promediaron 29 células EdU positivas por cerebro central.
Demostrando que la proliferación celular continúa al menos hasta la segunda semana después de una lesión cerebral traumática penetrante. La respuesta proliferativa más fuerte en el cerebro central se observa cuando los cerebros se lesionan dentro de las primeras 24 horas después de la eclosión. A los siete días después de la eclosión, una lesión penetrante todavía causa un aumento significativo en la proliferación.
Sin embargo, a los 14 días, la capacidad de las células para dividirse disminuye significativamente a una célula en división por cerebro. Lo cual es similar al de los cerebros de control. Utilizando el sistema de etiquetado permatwin se detectaron más clones de permatwin en muestras lesionadas a los dos días, en dos semanas, en comparación con los controles.
Con el número de clones aumentando con el tiempo después de la lesión. Dos semanas después de la lesión hubo nuevas neuronas del cuerpo de hongos en el 50% de los cerebros lesionados. Estas nuevas neuronas proyectaron sus dendritas aproximadamente al cáliz del cuerpo del hongo, y los axones a los lóbulos del cuerpo del hongo.
Otras áreas del cerebro que parecieron regenerarse incluyen los lóbulos antenales del cuerpo elipsoide y el cuerno lateral. Asegúrese de usar un pin Minutien afilado cuando realice las lesiones cerebrales, ya que el uso de un pin opaco o doblado aumentará la mortalidad. También asegúrese de no empujar demasiado fuerte a las moscas con el pincel, ya que esto también aumentará la mortalidad.
Después de este procedimiento, la inmunohistoquímica se puede utilizar para cuantificar la autoproliferación y también para identificar nuevas neuronas y glía.
