Desenvolvemos um método para reativar células-tronco neurais quiescentes em explantes cerebrais de drosophila cultivadas. Este método pode fornecer fatores exógenos para a mídia cultural e pode avaliar a reativação do neuroblasto. Melhores terapias com células-tronco poderiam ser desenvolvidas por uma melhor compreensão de como as células-tronco quiescentes respondem a sinais extrínsecos e entram no ciclo celular.
Demonstrando o procedimento estará Susan Doyle, uma cientista de pesquisa do meu laboratório. Para começar a colher cuidadosamente aproximadamente 20 a 25 larvas recém-eclodidas da placa de ágar de uva sob um microscópio dissecando. Encha uma placa de Petri com cerca de dois mililitros de PBS e submerse a ponta da ferramenta contendo larvas em PBS por dois minutos.
Depois de dois minutos, coloque a placa em um ângulo para juntar o líquido na parte inferior, e usando um pequeno pincel de tinta, escove as larvas do líquido até o fundo da placa de Petri. Colete todas as larvas na escova de tinta e enxágue as larvas brevemente em 70% de etanol antes de transferi-las de volta para a placa de Petri contendo PBS. Pulverizar a área de trabalho, ferramentas de dissecção, fórceps e dois pratos de relógio de vidro com 70% de etanol e deixá-los secar no banco.
Faça o meio de cultura de Schneider complementado, ou SSM, e coloque-o no gelo. Pipeta um mililitro do meio em cada prato de relógio de vidro. Usando uma micropipette com ponta estéril, transfira as larvas recém-eclodidas da placa de PBS para o SSM no primeiro prato de relógio de vidro.
Disseque os cérebros das larvas colocadas no segundo prato de relógio de vidro com SSM usando fórceps sob um microscópio dissecando e ajustando a ampliação conforme necessário. Use um fórceps para pegar os ganchos da boca, e com o outro, pegue suavemente o corpo no meio do caminho e puxe na direção oposta para dividir a larva em dois pedaços. Depois de dissecar de 15 a 20 cérebros, adicione um mililitro de SSM em um poço de uma bandeja de cultura de 24 poços estéreis.
Usando uma micropipette e uma ponta estéril, transfira os cérebros recém-dissecados para o SSM, seguido pela incubação da mídia com cérebros por 24 horas a 25 graus Celsius. Pipeta 10 microliters de um estoque de 10 milimolar de 5-ethynyl-2'deoxyuridina, ou EDU, com 990 microliters de SSM em um tubo de microcentrifuuge estéril, misture, em seguida, pipeta um mililitro de SSM EDU em um poço da bandeja de cultura estéril de 12 poços. Transfira os cérebros usando uma micropipette com uma ponta estéril do poço que contém SSM para o novo poço que contém a solução SSM EDU e incubar por uma hora a 25 graus Celsius.
Em seguida, transfira os cérebros rotulados pela EDU para outro poço na mesma bandeja de cultura contendo um mililitro de fixação e permita que os cérebros sejam consertados por 20 minutos. Após a fixação, transfira rapidamente os cérebros para um minitray well de 72 poços usando uma micropipette. Enxágüe o cérebro três vezes em 10 microlitrais de PBT e repita três lavagens por 10 minutos cada, garantindo que os cérebros estejam sempre cobertos com algum líquido.
Pipeta 10 microliters de solução de bloqueio no cérebro. Cubra a bandeja e sele-a com uma tira de parafilm ao redor da borda. O número mostra células neuroblastos EDU positivos e sem saída após 24 horas de cultivo em SSM com insulina e coloração.
Depois de 24 horas na mídia de Schneider complementada sem insulina, os cérebros selvagens recém-criados do Oregon R não tinham células neuroblastos de grande porte e positivas, além das células neuroblastos de quatro cogumelos e uma célula neuroblasto ventrolateral. Durante a imagem confocal, alguns hemisférios cerebrais com danos, como pequenos a grandes buracos no tecido cerebral explantado, foram ocasionalmente observados. Nenhum cérebro com buracos não foi usado para análise.
Disseque os tecidos cuidadosamente e pipeta suavemente para evitar qualquer dano tecidual. Também tente ser o mais estéril possível e não contaminar suas culturas. Como a mídia cultural pode ser facilmente manipulada adicionando diferentes fatores, essa técnica pode ser usada para abordar hipóteses futuras em relação à sinalização extrínseca e à entrada e saída da quiescência neuroblasto.
