Hi.In este vídeo, você aprenderá a realizar estudos de RM hiperpolarizados do coração de rato perfundido. David Shaul, um estudante de MD / PhD no laboratório, irá guiá-lo através das várias técnicas e procedimentos. Hoje aprendemos um protocolo para estudar o metabolismo hiperpolarizado do piruvato de carbono-13, combinado com espectroscopia de RMN 31P.
O metabolismo do piruvato está na encruzilhada do metabolismo aeróbico e anaeróbico. E, como tal, é de grande valor para estudar várias condições do coração. Então, vamos começar.
O coração do rato é isolado e perfundido com tampão de Krebs-Hensleit, dentro de um tubo de RMN de 10 milímetros. O coração é então inserido no espectrômetro de RMN. Lá, um espectro 31P é registrado para observar a energia cardíaca e o pH, observando as ressonâncias de trifosfato de adenosina, fosfocreatina e fosfato inorgânico.
Enquanto isso, uma amostra de piruvato que é marcada com carbono-13 na primeira posição é hiperpolarizada. E após a dissolução ocorre, é injetado no coração para permitir a medição de lactato, inorgânicos e piruvato as atividades organizadas em tempo real. Um dia antes do experimento, prepare 400 mililitros de tampão Krebs-Henseleit modificado.
Como primeiro passo, resolvemos estes ingredientes em água duplamente destilada. Em seguida, borbulhe esta solução com esta mistura de oxigênio por 20 minutos e, em seguida, adicione cloreto de cálcio. Ajuste o pH para 7,4.
No dia do experimento, adicione glicose e insulina. Ajuste o banho-maria a 40 graus Celsius. Insira o frasco médio com 200 mililitros de KH tampão no banho.
Use a bomba peristáltica para reciclar o buffer KH. Conecte-se a ele, uma linha de entrada e duas linhas de saída. Insira as linhas de entrada e saída no buffer KH aquecido.
Use um misturador de oxigênio com 95%O2 e 5%CO2. Em seguida, insira a linha de oxigênio no tampão KH aquecido. Ligue a bomba peristáltica e ajuste-a a um peso de fluxo constante de 7,5 mililitros por minuto.
Queremos calibrar o sistema antes de introduzir o coração. Portanto, insira as linhas de entrada e saída em um tubo de RMN de 10 milímetros e insira a sonda de temperatura óptica compatível com RMN. Insira o tubo de RMN no furo do ímã.
Ajuste o tanque de aquecimento a 42 graus Celsius e use o aquecimento NMR para ajustar a temperatura dentro do ímã para 37 graus Celsius. Observe que a temperatura de RMN é realmente monitorada no buffer KH que está dentro do ímã, usando um núcleo de temperatura compatível com RMN. Agora, podemos usar espectroscopia 31P para observar o sinal de fosfato inorgânico dentro do tampão.
Este é o equipamento que é necessário para o procedimento cirúrgico. Coloque 100 mililitros de tampão KH no gelo e borbulhe-o com a mesma mistura de oxigênio. Anestesiar o rato dentro da câmara da caixa com isoflurano a 3,3% misturado com ar ambiente para indução, a uma taxa de fluxo de 340 mililitros por minuto.
Transfira o rato para anestesia nasal. Reduzir para 2,9%isoflurano na mesma taxa de fluxo. Aperte o pé para verificar um reflexo negativo de dor no pedal e que o rato está totalmente anestesiado.
Injete no rato 300 unidades de heparina sódica, por via intraperitoneal. Corte a pele dois centímetros abaixo do processo xifoide. Corte a parede abdominal para expor a cavidade abdominal.
Coloque o grampo de tesoura entre o processo xifoide e a pele do peito e use-o para retrair a parede torácica e expor o diafragma. Puncione o lobo direito do diafragma e, em seguida, corte o resto do diafragma. Corte a linha média da parede torácica, evitando o contato com órgãos mais profundos, como o coração e os vasos.
Injete 200 unidades de heparina sódica no ventrículo esquerdo do coração. Injete o coração com 0,1 mililitros de 0,5 molar de KCL para atingir a parada cardíaca. Retraia o tecido do timo anteriormente e corte-o de sua raiz para expor a aorta abaixo dele.
Tente remover o máximo de tecido do timo que puder, evitando danos à aorta. Remova o tecido residual da caixa torácica para permitir a passagem livre para o cateter intravenoso. Coloque a pinça curva sob a aorta e use-a para colocar o nó de sutura de seda ao redor da aorta.
Coloque pinças curvas na raiz da aorta e retraia o coração inferiormente para expor e esticar a aorta. Injete três mililitros de tampão KH gelado no ventrículo esquerdo para remover coágulos sanguíneos da aorta e preservar a viabilidade do coração. Coloque várias gotas na superfície do coração também.
Use agulha de cateter intravenoso para puncionar a parede arterial da aorta sem danificar a parede posterior. Em seguida, insira o cateter com a agulha, cerca de três milímetros. Depois, remova a agulha e, simultaneamente, insira o tubo do cateter por mais cinco milímetros, mas evite entrar na câmara do ventrículo esquerdo.
Coloque o adesivo de cianoacrilato na região de punção da aorta, para evitar que o tubo do cateter deslize para fora da aorta enquanto aperta a sutura. Amarre suavemente um nó duplo entre a aorta e o tubo de canulação. Injete mais cinco mililitros de tampão KH no ventrículo esquerdo e verifique se ele flui através do tubo de canulação.
Isso marca que a canulação foi bem-sucedida. Remova a pinça curva da raiz aórtica. Desconecte o coração das vísceras circundantes, evitando o contato com o agente de canulação e com o tecido cardíaco.
Ligue imediatamente a cânula a uma seringa tampão KH gelada que flua. É importante evitar a introdução de bolhas de ar no coração. Remova o tecido não cardíaco.
Nesta fase, você deve observar o coração retomar o batimento. Corte as bordas restantes da sutura de seda. Na sala de RMN, desconecte a cânula da seringa e conecte-a ao tampão de 37 graus KH do sistema de perfusão.
Em seguida, insira o coração no tubo de RMN de 10 milímetros. Coloque o coração no centro da sonda e, em seguida, insira o tubo de RMN com o coração no furo do espectrômetro de RMN. Execute o calço" usando o sinal de água no canal de 1H até que a largura da linha de 10 a 20 hertz seja alcançada.
Em seguida, adquira espectros 31P do coração usando ângulo de inversão de 50 graus e TR de 1,1 segundo no estado estacionário. Essas condições favorecem o sinal de ATP, sobre os sinais de PCr e fosfato inorgânico. Observar os sinais de ATP e PCr, significa que o tecido é viável dentro do espectrômetro de RMN.
Use um programa de processamento dedicado para analisar os espectros. Realizar uperização exponencial de sete hertz. Use a correção basal e, em seguida, atribua o sinal de fosfocreatina a menos 2,5 ppm.
Observe os sinais de fosfato inorgânico, fosfocreatina e ATP. Polarizar a amostra de piruvato, que é marcada na primeira posição com carbono 13, durante 80 minutos. Após 80 minutos de polarização, a amostra está pronta para a solução.
É assim que ocorre a dissolução. Injete o conteúdo da dissolução no coração usando a abordagem de perfusão contínua. Esta abordagem foi projetada para fornecer o piruvato sem qualquer interrupção do nível de perfusão tecidual e oxigenação.
O meio de solução que contém o piruvato hiperpolarizado é injetado em um tubo cônico, depois injetado manualmente em um bypass e, em seguida, direcionamos a perfusão através do bypass e o conteúdo do bypass está fluindo através do coração continuamente e, eventualmente, desaparece. Usamos uma taxa de perfusão de 7,5 mililitros por minuto e um volume de bypass de 22 mililitros. Assim, que a mídia hiperpolarizada está fluindo através do coração por cerca de três minutos.
Nesta janela de tempo, usamos espectroscopia de carbono 13 para medir sinais de piruvato, lactato e bicarbonato. Utilizamos um esquema de excitação que alterna entre excitação de lactato e excitação de bicarbonato, com intervalos de seis segundos. Utilizou-se a excitação seletiva de saturação para adquirir o sinal de carbono 13.
Nesta abordagem, o substrato piruvato é minimamente excitado, enquanto os metabólitos, lactato e bicarbonato, são totalmente excitados. Observe e registre o metabolismo do piruvato de carbono 13 por cerca de três minutos. A investigação metabólica é concluída após o sinal de piruvato decair.
Esta figura mostra espectros de 31P gravados a partir de um coração de rato perfundido com buffer KH. O espectro adquirido do coração, mostra os sinais de alfa, beta e gama ATP, PCr e Pi.O sinal Pi é composto por dois componentes principais, O componente à esquerda, que aparece em um campo superior, representa o sinal Pi que é principalmente devido ao buffer KH a um pH de 7,4. A borda e o componente menos homogêneo à direita, que está em um campo inferior, mostra o sinal Pi que está em um ambiente mais ácido.
Este componente surge do tecido cardíaco. Em seguida, o sinal Pi do tecido foi obtido subtraindo o sinal Pi tampão de todo o sinal Pi. Foi então convertido de uma escala de ppm para uma escala de pH.
O pH é investigado usando uma análise multiparamétrica do sinal Pi tecidual calculando a média ponderada, a mediana ponderada, o máximo global e a assimetria. Esta figura mostra o espectro típico de RMN de carbono 13, obtido usando a abordagem de saturação-excitação seletiva de produto hiperpolarizado, durante a injeção de piruvato de carbono 13 hiperpolarizado no coração de camundongo perfundido. Observe os sinais de piruvato de lactato e bicarbonato.
O sinal de piruvato é truncado aqui para fins exibidos. As mudanças nas intensidades de sinal do substrato e dos metabólitos são devidas ao relaxamento do T1, à frequência de excitação e às características do fluxo. Em seguida, as intensidades integradas desses sinais são plotadas.
Além disso, foram plotados em círculos pretos, a intensidade integrada do piruvato que foi coletada para o decaimento T1 e para o efeito das excitações de frequência 4D, usando uma constante efetiva de tempo de decaimento de 32 segundos. Verificou-se que esta correção produziu a dinâmica de fluxo esperada para o substrato. Lavagem, platô e lavagem.
Usando este curso de tempo de sinal corrigido, selecionamos para análise posterior, a janela de tempo que é destacada em azul claro, na qual a concentração de piruvato no tubo de RMN, foi constante e máxima. As taxas de LDH e PDH foram calculadas para cada um dos momentos selecionados e, em seguida, calculadas as médias. Os principais valores para esta injeção são fornecidos em unidades de nanomol por segundo.
Em resumo, mostramos o sistema experimental para a realização de estudos metabólicos de piruvato hiperpolarizado no coração de camundongo perfundido. Esperamos que esta informação tenha sido útil.
