A fibrose tecidual é a principal forma de os órgãos falharem ao longo do tempo, em resposta à inflamação crônica ou ao envelhecimento. E na verdade, eu diria que se você não morrer de um agente infeccioso ou câncer, você provavelmente morrerá de fibrose de órgãos à medida que envelhece. Infelizmente, não há muitos modelos de ratos ótimos para imitar fibrose de tecido humano.
Então o que desenvolvemos é um modelo de camundongo da doença de Crohn, que é uma doença humana que causa fibrose do intestino e é em grande parte intratável. Na verdade, a única maneira de tratá-lo é através da remoção cirúrgica do tecido fibroso e re-ligação do intestino. A vantagem do nosso modelo é que ele é totalmente penetrante em todas as cepas de camundongos e imita muito de perto a doença de Crohn humana e a fibrose persiste por mais de um mês, que é realmente um modelo robusto.
A parte mais desafiadora deste procedimento é o manuseio dos camundongos e, especialmente, o gavage oral, uma vez que requer muita prática de certificação especial. Ao realizar este procedimento pela primeira vez, deve-se estar ciente de que trabalhar com Salmonella requer precauções de segurança adequadas e técnica estéril. O descarte de resíduos e bactérias deve ser planejado antes do experimento.
A demonstração visual deste procedimento é muito importante porque envolve o manuseio de Salmonella que requer precauções especiais de segurança, bem como técnica estéril adequada. Para iniciar este procedimento, estabeleça uma placa com ágar LB contendo Estreptomicina a uma concentração de 100 microgramas por mililitro. Usando um laço inoculante estéril, listrar a placa com um estoque de glicerol congelado de S typhimurium delta arrow a.
Incubar durante a noite a 37 graus Celsius. As placas de raia podem ser armazenadas a quatro graus Celsius por até uma semana. Um dia antes da infecção, dissolva 0,5 gramas de Estreptomicina em 2,5 mililitros de água para preparar o antibiótico.
O filtro esteriliza a solução de estreptomicina. Em seguida, use uma agulha de gavage de 22 bitolas com uma seringa de um mililitro para gavage oralmente os ratos com 100 microliters da solução de estreptomicina. Em seguida, adicione três mililitros de caldo LB contendo Estreptomicina a uma concentração de 50 microgramas por mililitro a um tubo de cultura.
Usando um laço de inoculação, inocular o caldo LB com uma única colônia. Incubar a cultura aerobicamente durante a noite a 37 graus Celsius com agitação a 200 rpm. No dia da infecção, realize duas diluições consecutivas de uma a 10 culturas salmonela durante a noite com PBS estéril para preparar a dose final de infecção.
Isso resulta em um 100 microliter inóculo contendo aproximadamente três milhões de unidades formadoras de colônias. Depois disso, use uma agulha de gavage de 22 bitolas com uma seringa mililitro para gavage cada rato com 100 microliters da Salmonella preparada. Primeiro, defina dois microtubos de fundo redondos de bloqueio seguro mililitros, adicione um mililitro de PBS estéril e uma conta de aço inoxidável autoclavada em cada tubo.
Pré-pesar os tubos antes da coleta de tecidos. Depois de eutanásia de camundongos, ressecize seus tecidos cecal e esplênicos, certificando-se de coletar tecidos de animais individuais em tubos separados. Pesar cada tubo para determinar os pesos teciduais.
Use um aparelho de moinho de mistura para homogeneizar os tecidos a 30 hertz por 15 minutos. Em seguida, transfira 900 microliters de PBS para cada poço de um mega bloco de 96 poços de dois mililitros. Pipeta 100 microliters de tecido homogeneiza no primeiro poço, e mistura bem.
Realize diluições seriais adicionando 100 microlitadores aos poços subsequentes, até que seja obtida uma diluição de 10 para a sexta diluição negativa. Placa 10 microliters de cada diluição em triplicados em ágar LB que contém Estreptomicina. Em seguida, conte as unidades de formação da colônia média e determine a colônia formando unidades por grama de tecido conforme descrito no protocolo de texto.
Abra fiji, que é um software de imagem de código aberto e arraste e solte o arquivo de imagem tif na barra de ferramentas. Na barra de menu, selecione Imagem, Tipo, pilha RGB para dividir a imagem em canais vermelho, verde e azul. Deslize a barra horizontal na parte inferior do painel para definir o canal para verde.
Ferramenta de imagem aberta, ajuste, limiar. Ajuste os limites mínimos e máximos para eliminar quaisquer sinais de fundo. Uma vez definido o limiar desejado, feche a ferramenta limiar e vá para Analisar, definir medidas, verificar área, fração de área, limite para limiar e etiqueta exibir.
Obtenha a seleção de tecidos com as seleções à mão livre ou a ferramenta seleções de polígonos e meça a área percentual positiva para colágeno clicando em Analisar, Medir. Em seguida, normalize a área absoluta positiva para a coloração de colágeno na área do tecido. Tratamento de estreptomicina seguido de infecção oral com seta delta de s typhimurium a leva a inflamação intestinal robusta e fibrose, especialmente no ceco.
Cargas típicas de patógenos de 100 milhões a um bilhão de unidades formadoras de colônias podem ser recuperadas por grama de ceco de animais infectados, enquanto 10 mil unidades formadoras de colônias podem normalmente ser recuperadas por grama de baço. A avaliação da fibrose nas seções de cecal manchadas vermelhas do picrosirius indica pico de fibrose 21 dias após a infecção, enquanto grande parte da patologia é resolvida até o dia 42 pós-infecção. A preparação completa dos materiais é essencial, pois este experimento requer vários dias para ser configurado.
A preparação das placas LB e Salmonella e Estreptomicina devem ser todas feitas asepticamente. Antes do experimento, certifique-se de que o experimentador esteja familiarizado com o protocolo animal, bem como com os riscos de segurança. Ao avaliar a carga de colágeno, o experimentador pode optar por realizar outros ensaios biológicos, como sequenciamento de RNA para avaliar perfis de expressão genética ou citometria de fluxo para avaliar subconjuntos de células imunes ou um tecido ELISA para avaliar perfis de citocinas.
Então nosso modelo é particularmente bom em imitar uma doença humana chamada doença de Crohn onde você tem fibrose do intestino, que é em grande parte intratável e a única maneira de tratá-lo é remover uma parte do intestino e costurá-la novamente e esperar que ele não volte. Nosso modelo é muito robusto e já mostramos que direcionar células linfoides inatas tipo três, um fator de transcrição chamado alfa cru, ou interleucina 17 ameniza a doença e previne a fibrose. Nosso modelo é particularmente bom em identificar os fatores que jogam na patogênese da doença de Crohn e fibrose intestinal e já estamos no caminho para identificar uma série de metas que poderiam ser tratadas terapeuticamente para aliviar a doença inflamatória intestinal.
Nosso modelo já entrou no mesmo acesso ILC3 ou alfa NIL17 pode estar em jogo em outras doenças fibrosas e isso inclui coisas como psoríase, esclerose múltipla, fibrose pulmonar idiopática. Portanto, é possível que direcionar esses mesmos fatores possa aliviar a fibrose nessas doenças também. Embora o fluxo mutante de Salmonella não seja virulento, é importante seguir os protocolos de segurança padrão de risco biológico dados pela instalação.
Além disso, uma vez que vapores de formaldeído são conhecidos por serem cancerígenos, é importante trabalhar atrás de um capô de fumaça durante a etapa de fixação.
