Este protocolo descreve uma estratégia terapêutica potencialmente nova que pode ser facilmente modificada para aplicações humanas. Esta técnica aumenta diretamente a indução de células T reguladoras de intestino em tecidos linfoides periféricos e pode ser implementada de forma estável mesmo em ambientes altamente pró-inflamatórios. Essas técnicas também podem ser usadas para investigar o papel da vitamina D ativa e da vitamina A dentro do sistema imunológico periférico.
Esta demonstração visual fornecerá instruções passo a passo para a geração de células dendríticas projetadas de alta qualidade que são fundamentais para o sucesso desta técnica. Comece semeando uma vez 10 para as sete células 293T em 20 mililitros de cm-10-D cultura celular média em 150 por 25 milímetros placas de cultura para uma incubação de 24 horas a 37 graus Celsius e 5% dióxido de carbono. No dia seguinte, adicione 1,62 mililitros de solução HBS recém-preparada duas vezes concentrada, 9,5 microgramas de plasmídeo envelope, 17,5 microgramas de plasmid de embalagem e 27 microgramas do plasmid LENTI-CYP-ALDH para um tubo cônico de 50 mililitros.
Traga o volume final do conteúdo do tubo até 3,0375 mililitros com água seguido pela adição de 202,5 microliters de dois cloreto de cálcio molar dropwise. Deixe a mistura de precipitação de DNA à temperatura ambiente por 20 minutos com mistura ocasional antes de adicionar 3,24 mililitros da solução dropwise por cultura 293T enquanto gira suavemente o prato. Coloque as placas na incubadora por 24 horas antes de lavar suavemente cada placa com PBS e alimentar as células com meio de cultura CM-4-D.
Após mais 24 horas de cultura, colde os supernantes em garrafas estéreis para armazenamento a quatro a oito graus Celsius e alimente as células com meio CM-4-D fresco por mais 24 horas. No quarto dia, colde novamente os supernantes e coe os supernantes dos dois dias três e quatro até um filtro de 0,45 micrômetros. Em seguida, concentre o vírus pseudotipado VSV-G por centrifugação por 24 horas.
No dia seguinte, decantar os supernantes. Deixe os tubos drenar em uma toalha de papel em um armário de biosegurança estéril por vários minutos, em seguida, resuspenque as pelotas em 33,3 microliters de PBS estéril contendo 5%glicerol por prato de cultura. Para a geração de células dendríticas derivadas da medula óssea, coloque as tíbias e os fêmures, colhidos de camundongos BALB/c, em um prato de cultura de 100 por 20 milímetros contendo meio de cultura fresca.
Use tesouras dissecando e fórceps para remover quaisquer tecidos dos ossos. Quando todos os ossos forem limpos, use a tesoura para cortar as duas extremidades de cada osso para expor as cavidades da medula óssea. Use uma seringa de 10 mililitros equipada com uma agulha de calibre 30 para lavar cada osso com 10 mililitros de meio de cultura fresca, coletando a medula óssea em um tubo de 15 mililitros.
Quando toda a medula óssea tiver sido coletada, sedimente a medula óssea por centrifugação e resuspense a pelota em dois mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos. Depois de quatro a cinco minutos em temperatura ambiente com agitação ocasional, pare a reação com 10 mililitros de cultura celular média e colete as células por centrifugação. Resuspenda a pelota em 10 mililitros de meio de cultura CM-10-R para contagem e ajuste as células por uma vez 10 para as seis células por mililitro de concentração média de cultura CM-10-R.
Em seguida, adicione 100 unidades por mililitro de GM-CSF murina recombinante e 10 unidades por mililitro de IL-4 às células. Placa quatro mililitros de células em poços individuais de uma placa de seis poços para sua incubação a 37 graus Celsius e 5% dióxido de carbono por 48 horas. No final da incubação, aspire suavemente as células não aderentes.
Adicione meio fresco complementado com GM-CSF e IL-4 às culturas antes de devolver as células à incubadora de cultura celular por uma adição de 48 horas. No final da segunda incubação, colmeia as células dendríticas derivadas da medula óssea não aderentes em tubo cônico de 50 mililitros para sua centrifugação. Para gerar células BMDC-CYP-ALDH, resuspenque as culturas em uma única vez dez a dez células dendríticas por 500 microliters de cm-10-R médio por concentração de poço, e placa 500 microliters de células em cada poço de uma nova placa de cultura de seis poços.
Adicione 50 microliters do vírus LENTI-CYP-ALDH e 8 microgramas por mililitro de protamina a cada poço, em seguida, coloque a placa na incubadora por 24 horas. No dia seguinte, substitua os supernacantes por meio de cultura fresca e devolva as placas à incubadora de cultura celular por mais 24 horas. Ao final da segunda incubação, as células podem ser ativadas com 100 nanogramas por mililitro de lipopolisacarídeo por poço por 24 horas antes da colheita para análises funcionais.
Em comparação com as células dendríticas derivadas da medula óssea dos pais, as células BMDC-CYP-ALDH apresentam uma expressão aprimorada de 1-alfa-hidroxilase. As concentrações da forma ativa de vitamina D nas supernaciantes culturais das células BMDC-CYP e BMDC-CYP-ALDH são aproximadamente 20 vezes maiores do que as observadas nas células dendríticas derivadas da medula óssea parental e nas culturas celulares BMDC-ALDH. As intensidades fluorescentes médias das células BMDC-CYP-ALDH tratadas com o substrato são aproximadamente seis vezes maiores do que as das células dendríticas derivadas da medula óssea dos pais tratadas com o substrato.
Isso sugere que as células BMDC-CYP-ALDH expressam atividade enzimática de desidrogenase-2 da retina significativamente melhorada. As células DC2.4 tratadas com 25-hidroxi vitamina D e retina não induzem uma mudança significativa na abundância de células T positivas CCR9 positivas CCR9. Em contraste, as células DC2.4 CYP-ALDH tratadas com 25-hidroxia d e retina induzem um número significativamente maior de células T reguladoras de escoamento intestinal de forma dependente da concentração.
Além disso, em comparação com células de controle injetadas intraperitoneal, as células DC CYP-ALDH também induzem um aumento significativo no número de células T positivas ccr9 positivas CCR9 positivas após injeção intraperitoneal em animais receptores BALB/c. O sucesso do procedimento depende da preparação de células T saudáveis e de uma mistura de DNA corretamente preparada.
