Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Califórnia de Medicina Regenerativa (RB3-02266) e do NIH (DK54441).

Notas antes de começar: <ol><li> Pancreata fetais humanos foram obtidos a partir dos defeitos congénitos Research Laboratory, da Universidade de Washington (Seattle, Washington, EUA), que colheu o tecido. O consentimento informado para a doação de tecido, armazenamento e utilização das amostras foi obtida a partir dos dadores pelo centro. O termo de consentimento protocolo foi fornecido por escrito e da Universidade da Califórnia, em San Diego Pesquisa Proteções Humanos Programa aprovado todo o estudo (Protocolo n 081237XT). </li><li> É essencial para manter tanto o pâncreas fetal humano e o recipiente que contém o pâncreas em gelo durante todo o procedimento. A dissociação e a digestão deverá ser executada tão rápido quanto possível. </li><li> Enviar clínica onde o pâncreas fetal humano foi obtido a partir da memória intermédia para o armazenamento e transporte do pâncreas. (RPMI-1640 + 10% de soro humano normal (NHS), 300 mM de trealose SG, penicilina / estreptomicina, e fungizona). </li></ol>1. Dissecção da fetais pâncreas humano <ol><li> Dissolve-se 5 mg de colagenase XI RT em HBSS para obter uma concentração final de 2,5 mg / ml. Filtrar esterilizar a solução com um filtro de seringa de 0,22 micron para um estéril (autoclavado) frasco de cintilação e armazenar a 4 ° C. Em uma capa de cultura de tecidos, estabelecido duas placas de Petri estéreis, um pequeno cadinho estéril (se um cadinho não estiver disponível, um pequeno copo pode ser substituído), tesouras e pinças esterilizadas. Adicionar 2 ml de HBSS para uma placa de Petri, para lavar o pâncreas. Líquido aspirado a partir do tubo que contém o pâncreas fetais, deixando cerca de 1 ml. </li><li> Retire do pâncreas com uma pinça na 60 milímetros placa de Petri sem HBSS. Para estes experimentos, CCIs fetais são gerados a partir pancreata fresco com idade gestacional variando de 9 a 23 semanas. Isolamento a partir de pâncreas em idades gestionational anteriores é difícil devido ao tamanho do pâncreas. O protocolo é aplicável a provável idade gestacional após 23 semanas, no entanto aquisição de pancreata após este tempo é difícil devido a restrições federais (EUA). Ocasionalmente, o pâncreas fetal chega com baço, gordura ou tecido conjuntivo anexado da dissecção originais. O tecido extra é facilmente visível a olho nu, e deve ser removido a partir do pâncreas, antes de iniciar o protocolo. </li><li> Lavar o pâncreas em um volume mínimo de HBSS frio (~ 0,5 ml) numa placa de Petri. </li><li> Mova o pâncreas limpas ao pequeno cadinho estéril usando uma pinça estéril e coloque em um balde de gelo. Colocar o cadinho de um suporte para um tubo de centrífuga de 50 ml e, utilizando 2 pares de tesouras, vigorosamente cortar o pâncreas durante vários minutos. (Normalmente 2-5 minutos, mas o tempo depende do tamanho e da firmeza do tecido). Técnica de corte é importante. Segurar um lado da tesoura numa posição fixa mover apenas as pegas opostas. As pontas das tesouras deve assentar no fundo do cadinho. Continue com o movimento tesoura rápida para quebrar o pâncreas em pequenospeças. Quanto menores forem os pedaços de tecido, melhor a colagenase funcionará. </li><li> Adicionar 1,5 ml de HBSS + pâncreas picada até o frasco contendo a colagenase e coloque em um conjunto agitador banho-maria a 37 ° C a 200 rpm por até 10 min. Não marque mais freqüentemente do que uma vez durante os primeiros 5 min. Tempo de digestão depende da qualidade do tecido, tão pouco quanto 6 minutos pode ser suficiente. O ponto final é quando as partículas são pequenas e uniformes. </li><li> Encha o frasco (10-15 ml) com HBSS frio para parar a atividade da colagenase. Coloque sobre o gelo e permitir que os aglomerados que se contentar com 10 min. Muitas vezes, a esta altura, alguns a morte celular ocorreu e DNA é liberado para os meios de comunicação. Isso pode tornar a mídia &#39;pegajoso&#39;; neste caso, adiciona-se 100 ul de ADNase (10 mg / ml) para a solução. </li><li> Depois que o tecido do frasco de cintilação decidiu-se por 10 minutos, aspirar a camada superior deixando-o um pouco menos de metade (7-8 ml). Transferência das células para um tubo cónico de 15 ml, Adicionar 5 ml de HBSS. Centrifugar durante 5 minutos a 300 x g. </li><li> Aspirar o HBSS e ressuspender as células em 5 ml de meio contendo meio RPMI-1640, glutamax, 10% de soro humano normal (NHS), 10 mM de HEPES pH 7,2, penicilina / estreptomicina e fungizona. Placa em 60 milímetros placa de Petri. Para os pesquisadores que tentam gerar células β, adicione HGF (10 ng / ml de solução final) para os meios de comunicação. Além disso, um certo número de grupos têm demonstrado que a suplementação do meio de cultura com a hormona incretina, GLP-1 também aumenta as células β 28. As células devem ser deixadas em suspensão durante 72 h, para agregar e formar CCI. </li><li> Depois de 72 horas em suspensão, as células podem ser semeadas em matriz da matriz HTB9 linha celular humana tal como descrito anteriormente 29. Independentemente das condições de crescimento, a mídia deve ser trocado a cada 48 horas. </li></ol> 2. Imunofluorescência de Marcadores de Proliferação Celular Endócrino e Maturação em CCIs Grown em suspensão, monocamada ou em lamínulas <ol><li> Para medir a proliferação celular, BrdU rotulagem de quer células aderentes ou células em suspensão é realizada durante 12 horas antes da fixação do PFA. Reagente de BrdU é diluída 1:100 e esterilizado por filtração em meio RPMI-1640, glutamax, 10% NHS, 10 mM de HEPES pH 7,0, penicilina / estreptomicina e fungizona. </li><li> No caso de células em suspensão: Centrifugar durante 5 minutos a 300 xg, e o meio de cultura aspirado. Adicionar 10 ml de PBS para lavar os CCI, centrifuga-se durante 5 min a 300 xg e aspirado. Se os CCIs serão incluídos em parafina, por favor, siga o protocolo opcional 3,1-3,17 Para células aderentes:. Remover meio de cultura e lavar as células com PBS, como descrito acima. Fixar as células durante 20 minutos com 4% de PFA em RT, em seguida, lavar duas vezes com PBS. Neste ponto, as placas podem ser embrulhados com Parafilm e armazenada em PBS a 4 ° C durante até 1 semana. </li><li> Incubar as células com 0,2% de Triton X-100 em PBS durante 10 min à temperatura ambiente. Lave as células duas vezes com PBS e aplicar tampão de bloqueio (2% de fazersoro nkey, 2% de albumina de soro bovino, 50 mM de glicina diluído em PBS) durante 1 hora. Lavar as células com tampão de Trabalho (Bloqueio Tampão diluído 1:10). Dilui-se o anticorpo em tampão de trabalho. Para as células que cresceram em lamelas de vidro, dilui-se o anticorpo em 60 ul de volume total. No caso de células em um prato de 6 poços, diluir o anticorpo em 600 ul de volume total. Para corar vários epítopos, um cocktail de anticorpos pode ser aplicado. Como controlo, usa IgG ou pré soro imune em vez do anticorpo específico. As amostras de controlo devem ser incubadas com IgG de controlo, da mesma espécie que o anticorpo primário a ser utilizado. </li><li> Incubar o anticorpo primário ou 1,5 horas à temperatura ambiente ou O / N a 4 ° C. Aspirar o anticorpo primário e lava-se 3x com tampão de trabalho à temperatura ambiente. </li><li> Dilui-se o anticorpo secundário a 1:200 de anticorpos conjugados com FITC e rodamina, 1:500 - 1:1000 para os anticorpos conjugados com Alexa. É importante observar que todos os anticorpos secundários são sensíveis à luz. Cubra as amostrasem papel de alumínio para evitar a perda de sinal. Incubar durante 1 hora à temperatura ambiente. Opcional: Para visualizar os núcleos, DAPI pode ser adicionado a 1:500 durante a incubação secundária. Isto é útil para a quantificação da expressão da proteína no total da população de células. </li><li> Aspirar o anticorpo secundário e lava-se 3x com tampão de trabalho à temperatura ambiente. Para células crescidas em lâminas, levantar suavemente as lamelas com fórceps enquanto mergulha no tampão; lavá-lo por imersão em PBS. Para células crescidas em uma placa de 6 poços, adicionar fosfato de modo a lavar e aspirado. Neste ponto, eles estão prontos para examinar sob um microscópio invertido. </li><li> Toque na borda da lamela suavemente em um Kimwipe para se livrar do excesso de PBS. Adicionar uma gota de gel de montagem em uma lâmina de vidro e inverta a lamela sobre a lâmina. Retire o excesso de gel de montagem por aspiração. Toque a lamela suavemente com a parte traseira de uma ponta de pipeta de 200 mL para remover bolhas. </li><li> Seca à temperatura ambiente durante cerca de 20 minutos ou O / N a 4 ° C e sob uma examinar fluorescent ou microscópio confocal. </li></ol> 3. (Opcional) Immunofluorescent Coloração de Proteínas de parafina CCIs Embarcados <ol><li> Prepare uma solução de agarose 3% e deixe esfriar para 55-60 ° C. </li><li> Transferir os CCIs incubadas em suspensão para um tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 1500 g durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Aspirar a mídia a partir de células e corrigir com 500 mL PFA 4% por 10 minutos em temperatura ambiente. Não misturar o sedimento, a menos que o pelete é muito grande. </li><li> Lava-se a pelete duas vezes com 750 ul de PBS. Como o PFA 4%, este resíduo é considerado perigoso e devem ser eliminados de acordo com as especificações de resíduos perigosos da sua instituição. </li><li> Agite suavemente o pellet celular para soltar e adicionar 150-200 mL de agarose para baixo a parede do tubo de 15 ml. </li><li> Misturar sacudindo suavemente o tubo, mas não se formam bolhas. </li><li> Deixa-se solidificar a 4 ° C durante 5-10 min. </li><li> Use uma agulha 21 G para desalojara pelota e coloque em um 15 ml novo tubo cônico. </li><li> Inclusão em parafina e preparação de secções em lâminas pode ser feito no local usando um micrótomo ou por suas instalações de microscopia do núcleo. </li><li> Retire a parafina de tecido, hidrato, e lava-se com água rapidamente. </li><li> Adicionar 0,2 M de glicina durante 30 min à temperatura ambiente para extinguir o aldeído restante. </li><li> Lava-se a corrediça duas vezes com PBS durante 2 minutos cada. </li><li> Para recuperação antigênica, trazer 10 mM tampão citrato (pH 6,0) a ferver sobre a placa quente. Mergulhe os slides no buffer, esperar por ele para voltar a ferver, e esperar por 15 min. </li><li> Retirar o copo do fogão. Aguarde cerca de 40 minutos para os slides arrefecer no buffer. </li><li> Lavar as lâminas duas vezes com H 2 O durante 5 min cada, lavar as lâminas com PBS duas vezes durante 5 min cada, bloquear com 2% de soro de burro normal em PBS, durante 1 hora. </li><li> Incubar com anticorpo primário diluído a concentração correcta no tampão de trabalho, contendo 0,2% de Triton X-100.Geralmente, o anticorpo primário é incubado durante a noite, se a coloração para os factores de transcrição e durante 1,5 horas, se a coloração para hormonas, marcadores de proliferação e / ou diferenciação. </li><li> Siga os passos de 2,3-2,9 descritos acima. </li></ol>

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D., Hayek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+hepatocyte+growth+factor/scatter+factor+to+increase+transplantable+human+fetal+islet+cell+mass.+Transplant.">Use of hepatocyte growth factor/scatter factor to increase transplantable human fetal islet cell mass. Transplant.</a> Proc. 26, 33-34 (1994).</li><li>Beattie, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+increase+human+islet+cell+mass+while+preserving+beta-cell+function.">A novel approach to increase human islet cell mass while preserving beta-cell function.</a> Diabetes. 51, 3435-3439 (2002).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Os métodos aqui apresentados permitem uma para gerar CCIs de pâncreas fetais humanos e subsequentemente imagem para os marcadores de proliferação celular e endoderme pancreático. O processo de dissociação do pâncreas humano fetal requerido cerca de 90 min, seguido de um período de formação de ICC 72 horas, uma abordagem que é substancialmente diferente dos protocolos para isolar células progenitoras de células β de rato. O protocolo aqui apresentado fornece um método reprodutível, que permite ao pesquisador explorar desenvolvimento pancreático fetal humano. Dois tipos diferentes de estudos longitudinais pode ser realizada. Em primeiro lugar, o potencial de gerar tipos de células funcionais do pâncreas (células ductais, as células exócrinas e células hormonais positivos) de diferentes idades gestacionais podem ser avaliados após o transplante. Em segundo lugar, a partir de um único ICCs idade gestacional podem ser cultivadas em cultura, tratadas com agentes farmacológicos seleccionados e transplantadas em diferentes pontos de tempo durante a cultura ICC para explorar as diferençasno destino da célula. Com os esforços tremendos sendo dirigidas a diferenciação hESC em células produtoras de insulina, os problemas associados com a secreção de insulina em resposta a estímulos fisiológicos estão novamente sendo revivido. CCIs Humanos fornecer um sistema modelo único para estudar este aspecto crítico da proliferação de células do pâncreas fetal e β desenvolvimento celular. Como acontece com qualquer protocolo para isolar as células dos tecidos, os detalhes são fundamentais para o sucesso. Um certo número de parâmetros são, infelizmente, fora do controlo do pessoal de laboratório que executa a experiência. Dois problemas encontrados por este laboratório incluem a má qualidade do material de partida e entrega de tecido não-pancreático. Tecido pancreático fetal saudável é firme a um corte em tesoura. Se os cortes de tecido com muita facilidade, é um sinal de que as enzimas pancreáticas começaram a digerir o próprio pâncreas. Deste infelizmente, não há recuperação ea preparação é melhor cancelada. Raramente, uma emtécnico experiente remoção do pâncreas vai confundir secções do intestino para o pâncreas. Estas amostras terá muito mais elasticidade do que um pâncreas e um lúmen notável estará presente. Mais uma vez, estas amostras devem ser descartadas. Quando o protocolo acima é seguido como descrito, raramente existem quaisquer problemas que surjam para lançar o isolamento fora da pista. Alguns pontos a serem lembrados para assegurar um isolamento suave incluem, para usar uma tesoura afiada para cortar pâncreas precisa e ter a certeza de não deixar qualquer amostra de tecido grande demais para digerir. Se os cortes não são suficientemente pequenos, em seguida, a colagenase não funciona de forma eficaz, e alguns ICCs são formados. Por outro lado, quando se utiliza um novo lote de colagenase, começar com um nível semelhante se UI (unidades internacionais) para a digestão como utilizado anteriormente. No entanto, reduzir o tempo de incubação para assegurar que durante a digestão não ocorre. Esta solução de problemas técnica garante que o rótulo IU não varia significativamente de lote para batch. Tomados em perspectiva, esta técnica de isolamento de vários CCI fetais humanos é relativamente padrão no campo. A maioria dos laboratórios confirmaram nossos resultados que a adição de HGF para a mídia ajuda as células sobrevivem e proliferam 33. Em resumo, temos desenvolvido um método para isolar os CCI fetais humanos pâncreas fresco com idades gestacionais entre 9 e 23 semanas. As células podem ser cultivadas como uma monocamada ou em suspensão para as experiências de visualizar factores de transcrição endócrina do pâncreas e da insulina humana.

A principal limitação para terapias de reposição de insulina com base em células na diabetes tipo 1 é a escassez de ilhotas humanos disponíveis para transplante. A capacidade para regular a proliferação e diferenciação de células precursoras pancreáticos humanos em células produtoras de insulina que satisfaçam as exigências metabólicas de um estado deficiente de insulina continua a ser um bloco de construção fundamental para uma terapia baseada em células para o tratamento de diabetes tipo 1. Até ao advento das células produtoras de insulina, células estaminais embrionárias humanas, derivadas de células endócrinas pancreáticas fetais humanos ou dos seus precursores foram vistos como potenciais fontes de células para transplantes clínicos. Embora a paisagem científica e regulamentar mudou nos últimos anos, continua a haver uma necessidade vital para compreender como o pâncreas fetal humano desenvolve. Muitos agora ver o uso terapêutico de células de fetos humanos como improvável, no entanto, se foram estabelecidos métodos eficazes e seguros para expandir as células, o uso terapêutico dessas células poderia again ser explorado. Um grande obstáculo que resta é que na transformação vitro de células pancreáticas fetais humanos agregados (CCI) em glicose responsivo, insulina células secretoras endócrinas é atualmente um processo ineficiente. Apesar de muito trabalho ao longo de quase 30 anos elucidou e delineado o perfil de fatores de transcrição necessários para o desenvolvimento do pâncreas endócrino expressão, continuam a existir lacunas em nosso conhecimento sobre como expressão temporal de fatores de transcrição é regulada e relacionada com a função celular. Até ao advento das células produtoras de insulina, células estaminais embrionárias humanas, derivadas de células endócrinas pancreáticas fetais humanos ou dos seus precursores foram vistos como potenciais fontes de células para transplantes clínicos. Embora a paisagem científica e regulamentar mudou nos últimos anos, continua a haver uma necessidade vital para compreender como o pâncreas fetal humano desenvolve. Muitos agora ver o uso terapêutico de células de fetos humanos como improvável, no entanto, se eficaze métodos seguros para expandir as células foram estabelecidos, o uso terapêutico de tais células podem ser novamente explorada. Um grande obstáculo que resta é que na transformação vitro de células pancreáticas fetais humanos agregados (CCI) em glicose responsivo, insulina células secretoras endócrinas é atualmente um processo ineficiente. Apesar de muito trabalho ao longo de quase 30 anos elucidou e delineado o perfil de fatores de transcrição necessários para o desenvolvimento do pâncreas endócrino expressão, continuam a existir lacunas em nosso conhecimento sobre como expressão temporal de fatores de transcrição é regulada e relacionada com a função celular. Recentemente, o domínio de células estaminais empregou o conhecimento acumulado sobre temporais expressão do factor de transcrição durante o desenvolvimento da ilhota para dirigir a produção de células que expressam os marcadores de células endócrinas maduros. Embora gênese de células produtoras de insulina de células estaminais embrionárias humanas e células pluripotentes induzidas (iPSC) fez substancial eavanços significativos nos últimos anos, os protocolos mais eficazes requerem duas fases de diferenciação diferentes: 1) uma diferenciação precoce in vitro para gerar células que expressam factores de transcrição precursor pancreáticas, seguido por 2) in vivo após o transplante de maturação - uma chamada &quot;caixa preta &quot;período. Para avançar, os avanços na compreensão da biologia subjacente ilhota maturação in vivo, independentemente da fonte de células, deve ser entendido em um nível bioquímico. A similaridade entre os resultados obtidos com CCI e células estaminais embrionárias humanas sugere que uma série de processos bioquímicos importantes que regulam a passagem de células precursoras pancreáticos humanos, em células secretoras de insulina, glicose responsivos maduras in vitro permanecem desconhecidos. A parte central desse entendimento será o de desenvolver novas metodologias para obter populações de células endócrinas funcionais a partir de células progenitoras do pâncreas e células estaminais embrionárias humanas exigirá não apenas aprox bioquímicaoaches que elucidar os eventos de maturação, mas os métodos para analisar as mudanças. Por que acreditamos que a imagem células pancreáticas fetais humanos é um aspecto crítico de identificar alterações na maturação ilhota? A resposta está em parte na busca histórica para gerar as células produtoras de insulina. Ambos os sistemas de cultura de tecidos e modelo para precursores e ilhotas pancreáticas têm permitido aos pesquisadores explorar as diferenças significativas que existem entre a maturação de ilhotas de animais e ilhotas humanas in vitro. Uma limitação para a exploração do desenvolvimento fetal pâncreas humano é que a idade gestacional que podem ser utilizados legalmente só dão origem a agregados de células heterogéneas. Apesar de as células humanas fetais isoladas assemelham ilhotas, coloração após a cultura in vitro a partir de 9-23 semanas de idade gestacional revela menos de 15% contêm marcadores de células endócrinas, com a maioria das células não coloração para as hormonas das ilhotas. No entanto, após o transplante e novivo de maturação, a grande maioria das células expressam marcadores endócrinos 6,25. Os resultados destes estudos estão sendo ecoado hoje com protocolos de diferenciação hESC que só são capazes de gerar populações modestas de células endócrinas positivas hormonais único após a diferenciação in vitro nos métodos. In vitro para aumentar populações de células hormônio positivo provavelmente vai fornecer informações sobre in vivo ilhota maturação. Além disso, a compreensão dos eventos moleculares que impulsionam o desenvolvimento pancreático fetal humano, provavelmente, melhorar os esforços para derivar células produtoras de insulina a partir de células estaminais embrionárias humanas e ainda delinear os mecanismos que regulam a regeneração celular β e transdiferenciação célula pancreática. As semelhanças entre células de pâncreas humano fetal e células estaminais embrionárias humanas maturação pode ser estendido para a função celular. Como as células de murídeo, ambas as células fetais humanas e células estaminais embrionárias humanas diferenciadas são capazes de libertar insulina em resposta à glicosedepois neoformação ilhota in vitro 26,27. No entanto, após o transplante em camundongos nude e maturação, ambos grupos de ilhotas como humanos e de células produtoras de insulina derivadas de células estaminais embrionárias humanas apresentam um fenótipo endócrino. Três meses após o enxerto, cerca de 90% das células transplantadas ou de população são de insulina positivo, e funcionar normalmente, tal como determinado pela libertação de péptido C 17,26. Estes resultados indicam que o transplante proporciona contexto e não identificados sinais que promovem a maturação ilhota. Protocolos de imagem optimizada, como a descrita aqui, para as células pancreáticas fetais humanos vai ajudar na busca para identificar os fatores que modulam e acelerar a maturação. Exploração bioquímica Fundamental de células pancreáticas fetais humanos e células estaminais embrionárias humanas diferenciados para uma linhagem endócrina nesta fase de desenvolvimento é essencial para medir a eficiência de maturação. O protocolo seguinte, esboçado no Figure 1, fornece o método actual para o isolamento de células pancreáticas fetais humanos, chamado CCIs de pâncreas fetal humano inteiro e imagiologia destas células. Este protocolo necessita de uma preparação inicial de células a partir de tecido, que pode ser subsequentemente cultivada como uma monocamada ou em suspensão. Preparação de células para imagiologia de marcadores usados ​​de proliferação de células do sistema endócrino e maturação é descrita. Geração e imagiologia de ICC na ausência ou na presença de uma variedade de agentes químicos modificação proporciona um método rápido, em comparação com os modelos de transplante, para ajudar a identificar as condições de cultura e os compostos que aceleram a maturação de células pancreáticas fetais humanos em exócrina totalmente funcional, ductal, ou hormona produzir células pancreáticas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1000">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:349px;">Trehalose SG</td>
			<td style="width:219px;">Hayashibara</td>
			<td style="width:115px;">Trehalose SG</td>
			<td style="width:319px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase XI&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-9407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI 1640 with glutamate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11879020</td>
			<td>no glucose or HEPES</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human AB Sera, Male Donors</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>HS-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fungizone</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin Solution 50 mg/ml</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1M Hepes, pH 7.0</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin - Streptomycin 100X Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hepatocyte Growth Factor (HGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GLP-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>130-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dnase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile Petri Dishes, 60 x 15 mm; Stackable, venting ribs</td>
			<td>Spectrum Laboratory Products, Inc.</td>
			<td>D210-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">16% PFA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Donkey Serum&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BrdU</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>00-0103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-insulin (mouse monclonal; 1:1000)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I2018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-glucagon (mouse monoclonal; 1:2000)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PDX1 (mouse monoclonal)</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP1-47910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PDX1 (goat polyclonal)</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>47383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PDX1 (rabbit polyclonal)</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>47267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFluor 546 (rabbit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFluor 546 (mouse)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFluor 488 (rabbit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFluor 488 (mouse)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ki67</td>
			<td>Lab Vision Neomarkers</td>
			<td>RM 9016-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pan-CK (mouse monoclonal; 1:100)</td>
			<td>Immunotech</td>
			<td>2128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CK19</td>
			<td>AbD Serotech</td>
			<td>MCA 2145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HTB9 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>5637</td>
			<td>see Beattie 1997 reference to generate matrix</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-6013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and imaging of human fetal pancreatic cell clusters

Para cerca de 30 anos, os cientistas demonstraram que ICCs fetais humanos transplantados sob a cápsula renal de ratinhos nus amadurecido em funcionamento das células endócrinas, tal como evidenciado por um aumento significativo na circulação de péptido-C humano após a estimulação da glucose 1-9. No entanto, in vitro, gênese de células produtoras de insulina de CCIs fetais humanos é baixa 10; resultados que lembram experimentos recentes realizados com células-tronco embrionárias humanas (hESC), uma fonte renovável de células que possuem uma grande promessa como um potencial tratamento terapêutico para diabetes tipo 1. Como CCIs, o transplante de células estaminais embrionárias humanas parcialmente diferenciado gerar glicose responsivo, as células produtoras de insulina, mas na gênese vitro de células produtoras de insulina de células estaminais embrionárias humanas é muito menos robusto 11-17. Uma compreensão completa dos fatores que influenciam o crescimento e diferenciação de células precursoras do sistema endócrino provavelmente vai exigir dados gerados a partir de ambos os CCIs e eleSC. Enquanto existir uma série de protocolos para gerar células produtoras de insulina a partir de células estaminais embrionárias humanas in vitro 11-22, muito menos existe para ICCs 10,23,24. Parte da discrepância que provavelmente vem a dificuldade de trabalhar com pâncreas fetais humanos. Para esse fim, nós continuamos a construir sobre os métodos existentes para isolar ilhotas fetais a partir de pâncreas humanos com idade gestacional variando de 12 a 23 semanas, crescem as células como uma monocamada ou em suspensão, e imagem para a proliferação celular, marcadores e hormônios pancreáticos humanos incluindo o glucagon e péptido-C. ICCs gerado pelo protocolo descrito abaixo resultado na libertação do peptídeo C após transplante sob a cápsula do rim de ratinhos nus que são semelhantes aos níveis de C-péptidos obtidos por transplante de tecido fresco 6. Embora os exemplos aqui apresentados concentrar-se a proliferação endoderme pancreático e β sintese de células, o protocolo pode ser utilizado para estudar outros aspectos do desenvolvimento pancreático, Incluindo exócrina, ductal, e outras células produtoras de hormonas.

A preparação cuidadosa dos CCIs fetal é fundamental para o sucesso deste protocolo. Representativos de imagens como as células normalmente olhar para períodos definidos após o plaqueamento são mostrados na Figura 2. Após purificação, os agregados de células recém-plaqueadas aparecem como pequenos aglomerados claras, escasso que contêm poucas células (Figura 2A). Após as primeiras 24 horas (Figura 2B), muitos dos aglomerados de células tornam-se maiores, mas numerosos pequenos aglomerados permanecem. Por 48 horas, os clusters têm se expandido significativamente, mas permanecem assimétrica (Figura 2C). Em 72 horas, os CCI deve ser clara, relativamente uniformes em tamanho e forma (Figura 2D). É neste ponto que as células podem ser semeadas em ou matrizes, tais como HTB-9, durante 24 horas antes de imunofluorescência ou deixaram-se crescer por mais 72 horas na ausência ou na presença de produtos químicos ou drogas que podem alterar a expressão de genes necessário para pancreático células endócrinas generation. Figura 3 destaca um número de anticorpos comumente utilizados para avaliar quer a proliferação ICC ou diferenciação para endoderme pâncreas. Na Figura 3A, os CCI foram semeadas em HTB-9, cultivadas durante 4 dias, e coradas para Pdx1, um marcador crítico de desenvolvimento pancreático. Embora a coloração in vitro de vários CCI é realizada rotineiramente no nosso laboratório, mais frequentemente, os CCI fetais humanos transplantados sob a cápsula renal de ratinhos nus e deixou-se proliferar e diferenciar in vivo 6,9,30-32. Em tempos específicos após o transplante, os ratos são sacrificados e os rins transplantados contendo os CCI é removido, fixo em paraformaldeído a 4% e embebidos em parafina. Seções 5 mícrons seqüenciais são gerados no local usando um micrótomo ou por uma instalação de microscopia núcleo. Desmascaramento Epitope e coloração das proteínas de parafina incorporado tecido para microscopia de imunofluorescência é descrita no protocolo facultativo 3.10-3.. 17 Na Figura 3B, CCIs transplantados foram coradas com o marcador de células pan citoqueratina epitelial (PanCK; verde) e com Ki67 (vermelho) para avaliar a proliferação celular. Em outro exemplo, a insulina humana (verde) e glucagon (vermelho) foram detectados após o transplante e maturação sob a cápsula renal de um ratinho nu (Figura 3C). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50796/50796fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Plano de preparação ICC fetal humano e coloração para Imunofluorescência de fluxo. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50796/50796fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Preparação fetal representativas ICCs a 0, 24, 48, ou 72 horas após o plaqueamento (A) CCI.em suspensão foram fotografada imediatamente após o plaqueamento, (B) 24 horas após o plaqueamento, hr (C) 48 após o plaqueamento, ou (D), 72 h após o plaqueamento. Barra de escala para AC, ampliação 10X = 300 mm, barra de escala para D, 20 ampliação = 100 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50796/50796fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50796/50796fig3highres.jpg" /> .. Figura 3 Imunofluorescência de CCIs banhado Rotineiramente, CCIs são gravadas para (A) a Pdx1 marcador endoderme pancreático (verde), (B), as células endócrinas (pan-CK; verde) e proliferação (Ki67, vermelho), (C) insulina (verde) e glucagon (vermelho). Barra de escala para AC, aumento de 40 vezes = 20 m.

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Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

Um protocolo para isolar, os clusters da cultura e imagem de células ilhotas (CCI) derivadas de células pancreáticas fetais humanos é descrito. O método detalha os passos necessários para gerar CCIs de tecido, cultura como monocamadas em suspensão ou na forma de agregados, e imagem para os marcadores de proliferação e decisões destino celular do pâncreas.

Isolamento, cultura, e imagem de Fetal Humano pancreáticas grupos de células

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

isolation-culture-and-imaging-of-human-fetal-pancreatic-cell-clusters

Research

JoVE Journal

Medicine

14.0K visualizações.  University of California, San Diego.  Um protocolo para isolar, os clusters da cultura e imagem de células ilhotas (CCI) derivadas de células pancreáticas fetais humanos é descrito. O método detalha os passos necessários para gerar CCIs de tecido, cultura como monocamadas em suspensão ou na forma de agregados, e imagem para os marcadores de proliferação e decisões destino celular do pâncreas. 

Vídeo: Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and beta mass ranges from 500 to 1500 mg 1-3. With this known heterogeneity, a standard processing and staining procedure was developed so that pancreatic regions were clearly defined and islets characterized using rigorous histopathology and immunolocalization examinations. 
Standardized procedures for processing human pancreas recovered from organ donors are described in part 1 of this series. The pancreas is processed into 3 main regions (head, body, tail) followed by transverse sections. Transverse sections from the pancreas head are further divided, as indicated based on size, and numbered alphabetically to denote subsections. This standardization allows for a complete cross sectional analysis of the head region including the uncinate region which contains islets composed primarily of pancreatic polypeptide cells to the tail region.
The current report comprises part 2 of this series and describes the procedures used for serial sectioning and histopathological characterization of the pancreatic paraffin sections with an emphasis on islet endocrine cells, replication, and T-cell infiltrates. Pathology of pancreatic sections is intended to characterize both exocrine, ductular, and endocrine components. The exocrine compartment is evaluated for the presence of pancreatitis (active or chronic), atrophy, fibrosis, and fat, as well as the duct system, particularly in relationship to the presence of pancreatic intraductal neoplasia4. Islets are evaluated for morphology, size, and density, endocrine cells, inflammation, fibrosis, amyloid, and the presence of replicating or apoptotic cells using H&amp;E and IHC stains. 
The final component described in part 2 is the provision of the stained slides as digitized whole slide images. The digitized slides are organized by case and pancreas region in an online pathology database creating a virtual biobank. Access to this online collection is currently provided to over 200 clinicians and scientists involved in type 1 diabetes research. The online database provides a means for rapid and complete data sharing and for investigators to select blocks for paraffin or frozen serial sections.

This video demonstrates procedures for characterization of human pancreatic islets using hematoxylin and eosin (H&E) and immunohistochemistry (IHC). Pancreatic sections from head, body, and tail regions are stained by both H&amp;E and IHC to determine islet endocrine composition (insulin, glucagon, and pancreatic polypeptide), cell replication (Ki67), and inflammatory infiltrates (H&E, CD3). The uncinate region is localized using IHC for pancreatic polypeptide.

Protocolos de coloração de ilhotas pancreáticas humanas

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

Medicina

Non-invasive Optical Measurement of Cerebral Metabolism and Hemodynamics in Infants

Perinatal brain injury remains a significant cause of infant mortality and morbidity, but there is not yet an effective bedside tool that can accurately screen for brain injury, monitor injury evolution, or assess response to therapy. The energy used by neurons is derived largely from tissue oxidative metabolism, and neural hyperactivity and cell death are reflected by corresponding changes in cerebral oxygen metabolism (CMRO2). Thus, measures of CMRO2 are reflective of neuronal viability and provide critical diagnostic information, making CMRO2 an ideal target for bedside measurement of brain health.
Brain-imaging techniques such as positron emission tomography (PET) and single-photon emission computed tomography (SPECT) yield measures of cerebral glucose and oxygen metabolism, but these techniques require the administration of radionucleotides, so they are used in only the most acute cases.
Continuous-wave near-infrared spectroscopy (CWNIRS) provides non-invasive and non-ionizing radiation measures of hemoglobin oxygen saturation (SO2) as a surrogate for cerebral oxygen consumption. However, SO2 is less than ideal as a surrogate for cerebral oxygen metabolism as it is influenced by both oxygen delivery and consumption. Furthermore, measurements of SO2 are not sensitive enough to detect brain injury hours after the insult 1,2, because oxygen consumption and delivery reach equilibrium after acute transients 3. We investigated the possibility of using more sophisticated NIRS optical methods to quantify cerebral oxygen metabolism at the bedside in healthy and brain-injured newborns. More specifically, we combined the frequency-domain NIRS (FDNIRS) measure of SO2 with the diffuse correlation spectroscopy (DCS) measure of blood flow index (CBFi) to yield an index of CMRO2 (CMRO2i) 4,5.
With the combined FDNIRS/DCS system we are able to quantify cerebral metabolism and hemodynamics. This represents an improvement over CWNIRS for detecting brain health, brain development, and response to therapy in neonates. Moreover, this method adheres to all neonatal intensive care unit (NICU) policies on infection control and institutional policies on laser safety. Future work will seek to integrate the two instruments to reduce acquisition time at the bedside and to implement real-time feedback on data quality to reduce the rate of data rejection.

We combined frequency-domain near-infrared spectroscopy measures of cerebral hemoglobin oxygenation with diffuse correlation spectroscopy measures of cerebral blood flow index to estimate an index of oxygen metabolism. We tested the utility of this measure as a bedside screening tool to evaluate the health and development of the newborn brain.

Não-invasivo de medição óptica do metabolismo cerebral e Hemodinâmica em Lactentes

Perinatal brain injury remains a significant cause of infant mortality  and morbidity, but there is not yet an effective bedside tool that can  accurately ...

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual's tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.

A method to process human mammary surgical discard material is described. Processed tissue, in the form of organoids, can be stored frozen indefinitely or placed in culture for long-term growth. This method enables experimental examination of normal human epithelial cell biology, and the effects of exogenous perturbations.

Processamento da mamoplastia redutora e tecidos humanos Mastectomia para cultura de células

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Cultura de Células e Isolamento paciente Derivado de CD133<sup&gt; +</sup&gt; Células-tronco de câncer putativos Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

Protocolo melhorado para microdissecção a laser de ilhotas pancreáticas humanas a partir de espécimes cirúrgicos

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

Isolamento, criopreservação e cultivo de células epiteliais humanas Amnion para aplicações clínicas

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

A Mouse Fetal Skin Model of Scarless Wound Repair

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs across species but is age dependent. The transition from a scarless to scarring phenotype occurs in the third trimester of pregnancy in humans and around embryonic day 18 (E18) in mice. However, this varies with the size of the wound with larger defects generating a scar at an earlier gestational age. The emergence of lineage tracing and other genetic tools in the mouse has opened promising new avenues for investigation of fetal scarless wound healing. However, given the inherently high rates of morbidity and premature uterine contraction associated with fetal surgery, investigations of fetal scarless wound healing in vivo require a precise and reproducible surgical model. Here we detail a reliable model of fetal scarless wound healing in the dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

During mammalian development, early gestational skin wounds heal without a scar. Here we detail a reliable and reproducible model of fetal scarless wound healing in the cutaneous dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

Um modelo de pele Rato Fetal de reparação de feridas Scarless

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Modelo de Diabetes Tipo 2: Isolamento de ilhotas pancreáticas e células vivas 2-Photon Imagens de ilhotas intactas

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

Isolamento e Cultura de Expansão de células endoteliais específicos de tumores

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized stromal cells and immune cells, are responsible for the secretion of hormonal and inflammatory factors which are critical for successful blastocyst implantation, placental development and play a role in the initiation of labor at term and preterm. Many pregnancy complications can arise from perturbations of a fine balance of different cell populations comprising decidua. Alterations in the proportion of specific decidual cell types may disrupt these crucial processes and increase the risk of developing serious complications of pregnancy, such as embryo implantation failure, intrauterine growth restriction, preeclampsia and preterm labor. The protocol outlined here demonstrates a cost and time effective method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae. By combining enzymatic digestion and gentle mechanical disruption of the decidual tissue, a high yield of decidual cells was obtained with virtually no chorion contamination. Importantly, isolated decidual cells were characterized (stromal cells (55-60%), leukocytes (35%), epithelial (1%) or trophoblast (0.01%) cells) and maintained high viability (80%) which was confirmed by multicolor imaging flow cytometry assay. This protocol is specific to the decidua parietalis and can be adapted to first and second trimester placentae. Once isolated, decidual cells can be used for a multitude of experimental applications aiming to understand the role of different decidual cell sub-populations in pregnancy complications.

This protocol demonstrates a method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae which can be used for a variety of applications (i.e. immunocytochemistry, flow cytometry, etc.) aiming to study the role of different cell populations in pregnancy complications.

Isolamento de células humanas primárias do Decidual de membranas fetais de termo placentas

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...