Três experimentos clínicos sugeriram que o transplante de microbiota fecal carrega o potencial terapêutico para uma série de doenças humanas. Outros estudos mecanísticos ajudarão a trazer FMT de banco para cabeceira. Este método adota gavage oral para a rota de entrega, permitindo uma entrega de volume mais precisa e a rápida absorção.
Requer apenas habilidades técnicas moderadas. Demonstrando o procedimento estará Xioying Zhong, um pesquisador sênior associado do nosso laboratório. Comece preparando toalhas de papel estéreis, fórceps de extremidade contundente e tubos cônicos de 50 mililitros.
Coloque algumas toalhas de papel e fórceps em sacos automáticos separados e autoclave-os a 180 graus Celsius em fogo seco por 30 minutos. Pesar os tubos cônicos estéreis e anotar seu peso nos tubos. Ligue o armário de biossegurança na sala dos animais.
Pegue uma gaiola de rato limpa autoclaved sem qualquer roupa de cama e coloque-a no armário de biossegurança. Retire a tampa e o rack de alimentos e coloque-os dentro do armário. Coloque algumas toalhas de papel estéreis na parte inferior da gaiola e coloque o rack de metal de volta no topo da gaiola.
Identificar a idade combinada com os doadores fecais e colocar a gaiola do rato no armário de biossegurança. Abra a gaiola e pegue delicadamente um rato doador pela cauda e coloque-o no rack de metal em cima da gaiola limpa. Coloque a tampa da gaiola em cima do rack e espere o animal defecar.
Recolhe as pelotas fecais e as coloca em um tubo cônico de 50 mililitros estéreis. Puxe as pelotas por sexo. Pesar novamente o tubo e calcular o peso das pelotas fecais.
Prepare uma solução estéril adicionando solução de 10% glicerol ao soro fisiológico normal. Adicione 10 mililitros desta solução ao tubo cônico para cada grama de pelotas fecais. Homogeneize esta mistura em baixa velocidade três vezes durante 30 segundos usando um homogeneizador de bancada dentro de um capô de fumaça para resuspensar as fezes.
Filtre a suspensão fecal através de duas camadas de gaze de algodão estéril. Armazene o filtrado temporariamente em uma geladeira por até seis horas, ou embale-o em frascos criogênicos estéreis e armazená-lo em um freezer de menos 80 graus. Limpe completamente o homogeneizador ou o liquidificador seguindo um procedimento padrão.
Descongele a suspensão fecal congelada no gelo se usar amostras congeladas. Misture a suspensão fecal descongelada por vórtice. Transfira a suspensão fecal fresca ou descongelar para uma seringa mililitro.
Pesar os ratos e escolher o tamanho certo da agulha de gavage e o volume máximo de dosagem. Teste a agulha de gavage medindo o comprimento da ponta do nariz do mouse até a parte inferior do esterno. Encha a seringa com 10% de glicerol em suspensão salina ou fecal e remova bolhas de ar dentro da seringa e da agulha.
Coloque uma gaiola de rato no armário de biossegurança. Retire a tampa da gaiola de plástico e deixe o rack de metal no lugar. Abra o rack de metal com uma mão.
Pegue um rato pela cauda e coloque-o no rack de metal. Segure o rato pela cauda com uma mão e use o polegar e os dedos médios de outra mão para conter o animal, agarrando a pele sobre os ombros. Estenda suavemente a cabeça do animal para trás e segure a cabeça no lugar com uma mão.
Coloque a agulha de gavage em cima da língua dentro da boca. Avance suavemente ao longo da paleta superior até que a agulha atinja o esôfago. Passe a agulha suavemente em um movimento.
Uma vez que a agulha esteja bem colocada e verificada, administre lentamente o material empurrando a seringa presa à agulha. Depois de dosar, puxe suavemente a agulha para fora. Marque o rato e devolva-o para sua gaiola.
Monitore o animal por cinco a 10 minutos procurando sinais de respiração ou angústia. Monitore os camundongos novamente entre 12 e 24 horas após o transplante de microbiota fecal. O imunoensaio da enzima revelou que o peptídeo natriurético do tipo B foi marcadamente elevado no plasma de camundongos deficientes interleucina.
Um transplante de microbiota fecal saudável atenuou significativamente o aumento dos níveis de peptídeos natriuréticos do tipo B. A ecocardiografia detectou uma diminuição significativa na fração de ejeção do ventrículo esquerdo nos camundongos deficientes interleucina 10 em comparação com os camundongos do tipo selvagem. A redução foi significativamente revogada pelo transplante de microbiota fecal.
Esses achados sugerem que o transplante de microbiota fecal saudável do doador atenuou a colite induzida pelo comprometimento cardíaco. Ao tentar o protocolo, escolher a agulha de gavage certa é essencial. Tubos de alimentação de plástico flexíveis podem ser uma escolha melhor para iniciantes.
Também é importante praticar o manuseio de animais antes do gavage.
