Questo protocollo è significativo in quanto consente di identificare l'interazione pianta-fungo. Oltre a colorare la pectina, dimostra anche difetti sul polimero della parete cellulare patogena e consente l'identificazione delle strutture fungine. Questa tecnica semplice e senza complicazioni può essere eseguita utilizzando la microscopia ottica e non richiede alcuna attrezzatura costosa come il microscopio elettronico a scansione.
Inoltre, è una tecnica veloce che ottiene un'eccellente distinzione di strutture vegetali per studi istopatologici. La tecnica identifica l'interazione pianta-fungo. Quindi, collabora per diagnosticare le malattie causate da funghi biotrofici e necrotrofici come la ruggine del caffè e la cercosporiosi.
Per iniziare, raccogliere e circa 10 millimetri quadrati di campione di foglie nella regione centrale della lesione usando un bisturi e una pinzetta e immergerlo in 30 millilitri di soluzione fissativa Karnovsky. Sottoporre il campione di foglie a un basso vuoto da 500 a 600 millibar per 15 minuti utilizzando una pompa dell'olio, almeno quattro volte per aumentare la permeabilità della soluzione fissativa nel tessuto fogliare. Dopo la fissazione, lavare il campione di foglie tre volte in un tampone cacodilato da 0,5 M diluito in acqua distillata per cinque minuti ciascuno, quindi trasferirlo in una serie etanolica graduata per 15 minuti a ciascuna concentrazione di etanolo.
Per trasferire gradualmente i campioni al glicole metacrilato, creare la soluzione A mescolando un grammo di polvere di glicole metacrilato con 100 millilitri di resina basica sotto agitazione magnetica. Quindi, immergere i campioni in rapporto uno a due della soluzione A e al 100% di etanolo per tre ore. Immergere i campioni in rapporto uno a uno per la soluzione A: 100% di etanolo per tre ore, quindi immergerli in una resina basica pura per due o quattro giorni.
Sottoporre il campione a un basso vuoto almeno quattro volte al giorno per 15 minuti, seguito dalla rotazione. Mescolare 15 millilitri di soluzione A con un millilitro dell'indurente in un becher con rotazione per due minuti per produrre la soluzione di polimerizzazione B.Put 1,2 millilitri di questa soluzione di polimerizzazione B in stampi di plastica. Utilizzando un plettro di legno, trasferire i campioni di foglie lesionate dalla resina basica pura alla soluzione B ed evitare l'uso di pinzette in quanto possono causare lo schiacciamento dei tessuti.
Assicurarsi di orientare rapidamente i campioni di foglie perpendicolarmente agli stampi in plastica poiché la soluzione B diventa rapidamente viscosa. Quando si ottiene l'orientamento perpendicolare dei campioni di foglie, attendere 30 minuti e quindi trasferire lo stampo di plastica in una camera di plastica o vetro contenente gel di silice per evitare l'umidità. Una volta che la resina e il campione di foglie sono polimerizzati dopo due o tre ore, staccare il blocco risultante dallo stampo di plastica levigando la base del blocco con una lima di levigatura.
Quindi, incollare il blocco su un pezzo di legno. Tagliare il blocco in sezioni spesse cinque micrometri utilizzando un microtomo rotante dotato di lame in acciaio di otto centimetri. Posizionare le sezioni su vetrini ricoperti di acqua distillata.
Quindi, trasferire le diapositive su una piastra calda per asciugare a 40 gradi Celsius e favorire l'adesione delle sezioni alle diapositive di vetro. Dopo l'essiccazione, etichettare i vetrini con il nome di riferimento del blocco e il numero della diapositiva. Coprire le sezioni con due millilitri di blu cotone al 5% in lattofenolo e riscaldarle su una piastra calda a 45 gradi Celsius per cinque minuti.
Rimuovere il colorante in eccesso lavando la diapositiva tre volte in un becher pieno di acqua distillata. Macchialo con due millilitri di rosso rutenio allo 0,01% in acqua per un minuto. Rimuovere il colorante in eccesso lavando la diapositiva tre volte in un becher pieno di acqua distillata.
Mettere una goccia di acqua distillata sopra le sezioni e coprire le sezioni con un coperchio per eseguire l'analisi al microscopio ottico. Nel metodo della doppia colorazione, Hemileia vastatrix hyphae contenente pareti cellulari e il denso contenuto di protoplasti apparivano blu scuro sia nel parenchima spugnoso che in quello palizzata. Anche la cellula madre dell'haustorium e l'haustoria mostravano un colore blu scuro.
La controcolorazione con rutenio rosso chiaramente definito distribuzione fungina negli spazi intercellulari. Durante l'interazione, la cellula madre di Hemileia vastatrix haustorium ha rotto la parete cellulare ospite e ha sviluppato un collo haustoriale circondato da composti pectici. L'incapsulamento di colore rosa-rosso ricco di pectina del collo haustoriale non può impedire la formazione haustoriale.
In alcuni casi, l'incapsulamento ricco di pectina ha racchiuso l'haustorium in modo incompleto. E in alcuni casi, l'haustorium è completamente incapsulato. La parete cellulare ricca di pectina mantiene l'integrità al bordo della lesione, dove il fungo non è presente.
Il metodo della doppia colorazione ha dimostrato la presenza di ife intercellulari. Nelle zone di interazione, le pareti cellulari della pectina sembravano perdere la loro integrità a causa della dissoluzione. Strutture riproduttive come i conidi sono state trovate nell'epidermide adassiale.
Cercospora coffeicola hyphae sono state trovate nella camera substomatica come strutture di curling, e il parenchima palizzata nella regione della lesione sembra subire la lisi della parete cellulare. Evitare l'uso di pinzette in quanto possono causare lo schiacciamento dei tessuti. Ulteriori studi istopatologici su ruggini, antracnosi, cercosporiosi, smut e altre interazioni biotrofiche, emibiotrofiche e necrotrofiche pianta-fungine dovrebbero essere condotti per studiare il potenziale uso di questa tecnica in diversi patosistemi.
