Bu protokol, bitki-mantar etkileşimini tanımlamayı mümkün kıldığı için önemlidir. Pektinin renklendirilmesine ek olarak, patojen hücre duvarı polimerindeki kusurları da gösterir ve mantar yapılarının tanımlanmasına izin verir. Bu basit ve karmaşık olmayan teknik, ışık mikroskobu kullanılarak gerçekleştirilebilir ve taramalı elektron mikroskobu gibi pahalı ekipmanlar gerektirmez.
Ek olarak, histopatolojik çalışmalar için bitki yapılarının mükemmel bir ayrımını elde eden hızlı bir tekniktir. Bu teknik, bitki-mantar etkileşimini tanımlar. Bu nedenle, kahve pası ve cercosporiosis gibi biyotrofik ve nekrotrofik mantarların neden olduğu hastalıkları teşhis etmek için işbirliği yapmaktadır.
Başlamak için, bir neşter ve cımbız kullanarak lezyonun orta bölgesinde yaklaşık 10 milimetre kare yaprak örneği toplayın ve 30 mililitre Karnovsky fiksatif çözeltisine batırın. Yaprak numunesini, yaprak dokusundaki fiksatif çözeltinin geçirgenliğini arttırmak için bir yağ pompası kullanarak 15 dakika boyunca 500 ila 600 milibarlık düşük bir vakuma maruz bırakın. Fiksasyondan sonra, yaprak numunesini damıtılmış suda seyreltilmiş 0,5 M kakodilat tamponunda her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayın ve daha sonra her etanol konsantrasyonunda 15 dakika boyunca derecelendirilmiş bir etanolik seriye aktarın.
Numuneleri yavaş yavaş glikol metakrilatına aktarmak için, manyetik ajitasyon altında bir gram glikol metakrilat tozunu 100 mililitre bazik reçine ile karıştırarak Çözelti A'yı yapın. Daha sonra, numuneleri üç saat boyunca bir ila iki Çözelti A ve% 100 etanol oranında daldırın. Numuneleri Çözelti A:% 100 etanol için bire bir oranında üç saat boyunca daldırın, ardından iki ila dört gün boyunca saf bir bazik reçineye batırın.
Numuneyi 15 dakika boyunca günde en az dört kez düşük bir vakuma maruz bırakın, ardından rotasyon yapın. Polimerizasyon Çözeltisi B.Bu polimerizasyon Çözeltisi B'nin 1.2 mililitresini plastik kalıplara koyun. Tahta bir toplama kullanarak, lezyonlu yaprak örneklerini saf bazik reçineden B Çözeltisine aktarın ve doku ezilmesine neden olabileceğinden cımbız kullanmaktan kaçının.
B Çözeltisi hızla viskoz hale geldiğinden, yaprak numunelerinin plastik kalıplara dik olarak hızlı bir şekilde yönlendirildiğinden emin olun. Yaprak numunelerinin dik yönü elde edildiğinde, 30 dakika bekleyin ve ardından nemi önlemek için plastik kalıbı silika jel içeren plastik veya cam bir odaya aktarın. Reçine ve yaprak numunesi iki ila üç saat sonra polimerize edildikten sonra, blok tabanını bir zımparalama dosyası ile zımparalayarak elde edilen bloğu plastik kalıptan ayırın.
Ardından, bloğu bir tahta parçasına yapıştırın. Sekiz santimetre çelik bıçaklarla donatılmış döner bir mikrotom kullanarak bloğu beş mikrometre kalınlığında bölümlere ayırın. Bölümleri damıtılmış suyla kaplı cam slaytlara yerleştirin.
Ardından, slaytları 40 santigrat derecede kuruması için sıcak bir plakaya aktarın ve bölümlerin cam slaytlara yapışmasını teşvik edin. Kuruduktan sonra, cam slaytları blok referans adı ve slayt numarası ile etiketleyin. Bölümleri laktofenol içinde iki mililitre% 5 pamuk mavisi ile örtün ve beş dakika boyunca 45 santigrat derecede sıcak bir plaka üzerinde ısıtın.
Slaytı damıtılmış suyla doldurulmuş bir beherde üç kez yıkayarak fazla boyayı çıkarın. Bir dakika boyunca suda iki mililitre% 0.01 rutenyum kırmızısı ile lekeleyin. Slaytı damıtılmış suyla doldurulmuş bir beherde üç kez yıkayarak fazla boyayı çıkarın.
Bölümlerin üzerine bir damla damıtılmış su koyun ve ışık mikroskobu analizi yapmak için bölümleri bir kapak fişi ile örtün. Çift boyama yönteminde, hücre duvarları ve yoğun protoplast içeriği içeren Hemileia vastatrix hifleri hem süngerimsi hem de palisade parankimde koyu mavi renkte göründü. Haustorium ana hücresi ve haustoria da koyu mavi bir renk sergiledi.
Rutenyum kırmızısı ile karşı boyama, hücreler arası boşluklarda mantar dağılımını açıkça tanımladı. Etkileşim sırasında, Hemileia vastatrix haustorium ana hücresi konakçı hücre duvarını kırdı ve pektik bileşiklerle çevrili bir haustorial boyun geliştirdi. Haustorial boynun pektin bakımından zengin pembe-kırmızı renkli kapsüllenmesi haustorial oluşumu önleyemez.
Bazı durumlarda, pektin bakımından zengin kapsülleme, haustorium'u eksik bir şekilde kapladı. Ve bazı durumlarda, haustorium tamamen kapsüllenir. Pektin bakımından zengin hücre duvarı, mantarın bulunmadığı lezyon sınırındaki bütünlüğü korur.
Çift boyama yöntemi, hücreler arası hifaların varlığını gösterdi. Etkileşim bölgelerinde, pektin hücre duvarlarının çözünme nedeniyle bütünlüklerini kaybettiği görülmüştür. Adaksiyal epidermiste konidia gibi üreme yapıları bulundu.
Substomatik kamarada kıvrılma yapıları olarak Cercospora coffeicola hifaları saptandı ve lezyon bölgesindeki palisade parankimi hücre duvarı lizisine uğramış gibi görünüyor. Cımbız kullanmaktan kaçının, çünkü doku ezilmesine neden olabilirler. Paslar, antraknoz, cercosporiosis, smuts ve diğer biyotrofik, hemibiyotrofik ve nekrotrofik bitki-fungal etkileşimleri üzerine daha ileri histopatolojik çalışmalar, bu tekniğin farklı patosistemlerde potansiyel kullanımını araştırmak için yapılmalıdır.
