Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es die Identifizierung der Pflanzen-Pilz-Interaktion ermöglicht. Neben der Färbung des Pektins weist es auch Defekte am pathogenen Zellwandpolymer auf und ermöglicht die Identifizierung von Pilzstrukturen. Diese einfache und unkomplizierte Technik kann mit Lichtmikroskopie durchgeführt werden und erfordert keine teure Ausrüstung wie das Rasterelektronenmikroskop.
Darüber hinaus ist es eine schnelle Technik, die eine ausgezeichnete Unterscheidung von Pflanzenstrukturen für histopathologische Studien erhält. Die Technik identifiziert die Pflanzen-Pilz-Interaktion. Daher arbeitet es zusammen, um die Krankheiten zu diagnostizieren, die durch biotrophe und nekrotrophe Pilze wie Kaffeerost und Zerkosporiose verursacht werden.
Um zu beginnen, ernten Sie eine etwa 10 Quadratmillimeter große Blattprobe in der mittleren Region der Läsion mit einem Skalpell und einer Pinzette und tauchen Sie sie in 30 Milliliter Karnovsky-Fixierlösung. Setzen Sie die Blattprobe 15 Minuten lang mit einer Ölpumpe einem niedrigen Vakuum von 500 bis 600 Millibar aus, mindestens viermal, um die Permeabilität der Fixierlösung im Blattgewebe zu erhöhen. Nach der Fixierung waschen Sie die Blattprobe dreimal in 0,5 M Kakaopuffer, der jeweils fünf Minuten lang in destilliertem Wasser verdünnt ist, und geben Sie sie dann bei jeder Ethanolkonzentration für 15 Minuten in eine abgestufte ethanolische Serie.
Um die Proben allmählich auf Glykolmethacrylat zu übertragen, machen Sie Lösung A, indem Sie das eine Gramm Glykolmethacrylatpulver mit 100 Millilitern basischem Harz unter magnetischer Bewegung mischen. Dann tauchen Sie die Proben drei Stunden lang in das Verhältnis eins zu zwei von Lösung A und 100% Ethanol. Tauchen Sie die Proben drei Stunden lang im Verhältnis eins zu eins für Lösung A: 100% Ethanol ein und tauchen Sie dann zwei bis vier Tage lang in ein reines Basisharz.
Die Probe wird mindestens viermal täglich für 15 Minuten einem niedrigen Vakuum unterzogen, gefolgt von einer Rotation. Mischen Sie 15 Milliliter Lösung A mit einem Milliliter des Härters in einem Becherglas mit zweiminütiger Rotation, um die Polymerisationslösung B herzustellen.Geben Sie 1,2 Milliliter dieser Polymerisationslösung B in Kunststoffformen. Übertragen Sie die mit einem Holzmeißel versehenen Blattproben aus reinem Grundharz in Lösung B und vermeiden Sie die Verwendung einer Pinzette, da sie zu einer Zerkleinerung des Gewebes führen kann.
Stellen Sie sicher, dass die Blattproben schnell senkrecht zu den Kunststoffformen ausgerichtet werden, da Lösung B schnell viskos wird. Wenn die senkrechte Ausrichtung der Blattproben erreicht ist, warten Sie 30 Minuten und übertragen Sie dann die Kunststoffform in eine Kunststoff- oder Glaskammer, die Kieselgel enthält, um Feuchtigkeit zu vermeiden. Sobald das Harz und die Blattprobe nach zwei bis drei Stunden polymerisiert sind, lösen Sie den resultierenden Block von der Kunststoffform, indem Sie die Blockbasis mit einer Schleiffeile schleifen.
Kleben Sie dann den Block auf ein Stück Holz. Schneiden Sie den Block in fünf Mikrometer dicke Abschnitte mit einem rotierenden Mikrotom, das mit acht Zentimeter Stahlklingen ausgestattet ist. Legen Sie die Abschnitte auf Glasobjektträger, die mit destilliertem Wasser bedeckt sind.
Anschließend die Objektträger auf eine Kochplatte geben, um bei 40 Grad Celsius zu trocknen und die Haftung der Abschnitte auf den Glasobjektträgern zu fördern. Beschriften Sie die Glasobjektträger nach dem Trocknen mit dem Blockreferenznamen und der Objektträgernummer. Decken Sie die Abschnitte mit zwei Millilitern 5% Baumwollblau in Lactophenol ab und erhitzen Sie sie fünf Minuten lang auf einer heißen Platte bei 45 Grad Celsius.
Entfernen Sie den überschüssigen Farbstoff, indem Sie den Objektträger dreimal in einem mit destilliertem Wasser gefüllten Becherglas waschen. Färben Sie es mit zwei Millilitern 0,01% Ruthenium rot in Wasser für eine Minute. Entfernen Sie den überschüssigen Farbstoff, indem Sie den Objektträger dreimal in einem mit destilliertem Wasser gefüllten Becherglas waschen.
Legen Sie einen Tropfen destilliertes Wasser über die Abschnitte und bedecken Sie die Abschnitte mit einem Deckglas für die Lichtmikroskopie-Analyse. Bei der Doppelfärbungsmethode erschienen Hemileia vastatrix-Hyphen, die Zellwände und den dichten Protoplastengehalt enthielten, sowohl im schwammigen als auch im Palisadenparenchym dunkelblau. Die Haustorium-Mutterzelle und die Haustoria hatten ebenfalls eine dunkelblaue Farbe.
Die Gegenfärbung mit Rutheniumrot definierte die Pilzverteilung in den Interzellularräumen deutlich. Während der Interaktion brach die Mutterzelle Hemileia vastatrix haustorium die Wand der Wirtszelle und entwickelte einen haustorialen Hals, der von pektischen Verbindungen umgeben war. Die pektinreiche rosa-rote Verkapselung des Haustorialhalses kann die Haustorialbildung nicht verhindern.
In einigen Fällen umhüllte die pektinreiche Verkapselung das Haustorium unvollständig. Und in einigen Fällen ist das Haustorium vollständig gekapselt. Die pektinreiche Zellwand erhält die Integrität an der Läsionsgrenze, wo der Pilz nicht vorhanden ist.
Die Doppelfärbungsmethode zeigte das Vorhandensein von interzellulären Hyphen. In Interaktionszonen schienen die Pektinzellwände durch Auflösung ihre Integrität zu verlieren. Fortpflanzungsstrukturen wie Konidien wurden in der adaxialen Epidermis gefunden.
Cercospora coffeicola hyphee wurden in der substomatischen Kammer als Curling-Strukturen gefunden, und das Palisade-Parenchym in der Läsionsregion scheint einer Zellwandlyse zu unterliegen. Vermeiden Sie die Verwendung einer Pinzette, da diese zu einer Zerkleinerung des Gewebes führen kann. Weitere histopathologische Studien zu Rost, Anthracnose, Zerkosporiose, Schmutz und anderen biotrophen, hemibiotrophen und nekrotrophen Pflanzen-Pilz-Interaktionen sollten durchgeführt werden, um den möglichen Einsatz dieser Technik in verschiedenen Pathosystemen zu untersuchen.
