As linhas celulares HCC4017 e HBEC30KT foram gentilmente cedidas pelo laboratório do Dr. John Minna. Este trabalho foi apoiado pelos Cecil H. e Ida verdes fundos para Dr. Li Zhang.

CUIDADO: Ao trabalhar com radioatividade, tomar as precauções adequadas para evitar a contaminação do experimentador e os arredores. Elimine todos os resíduos fora de seguir as diretrizes de segurança de radiação local. 1. Preparação de células <ol><li> Semear as células em placas de 3,5 centímetros de tal modo que a confluência atinge 80% -90% em relação ao dia do ensaio. <ol><li> Note-se que sementeira confluência de células depende do tipo de célula e a sua taxa de crescimento. Quando o tratamento de células com um reagente para um certo número de dias, as células semente de modo que a confluência é de 80% -90% no dia da medição do heme. Se o número de células obtido a partir de 3,5 centímetros placas é insuficiente, usar 6 centímetros placas com a mesma quantidade de ALA radioactivos como no passo seguinte. Nota: A utilização de placas individuais é recomendado porque é mais fácil de lidar com placas individuais. </li></ol></li><li> Um dia antes da medição do heme, adicionar 0,1-0,3 uCi [14 C] 5-ALA ALA e frio para chegar a um final concentration de 20? M de ALA total a cada placa de cultura em um ajuste da área de trabalho para trabalhar com materiais radioativos e colocar as placas de volta para a incubadora. Idealmente, incubar com radioativo ALA durante 16 horas. Nota: radiomarcado 5-ALA necessário pode variar entre linhas celulares. Uma contagem radioactiva por minuto (cpm) de, pelo menos, 100 é necessário para minimizar o erro associado a contagem. É aconselhável determinar uma quantidade mínima de [14 C] 5-ALA necessário para as linhas celulares em estudo. Para a maioria dos experimentos 0,1-0,3 ï¿½i é suficiente para obter uma boa medição. A adição de frio ALA é opcional. </li></ol> 2. Heme Extração <ol><li> Coloque as placas de cultura de células em gelo e levá-los para a área apto para o trabalho radioatividade. <ol><li> Executar toda a extração e processo de evaporação em um capuz prova de explosão. Porque o éter armazenadas podem explodir, utilize o éter em pequenas garrafas e evaporar quaisquer líquidos restantes, não armazene em éterum frasco aberto há mais de um mês. Não use acetona perto de chamas e aquecedores, pois é altamente inflamável. Loja acetona contendo reagentes em garrafas de vidro, uma vez que se dissolve plásticos de cultura de tecidos. </li></ol></li><li> Aspirar fora do meio utilizando uma pipeta. Lave as células uma vez com 1 ml de PBS frio 1x. Aspirar off PBS. </li><li> Adicionar 1 ml de 1x PBS frio para as placas e recolher as células na parte inferior da placa utilizando um polícia de borracha. Transferir as células recolhidas a partir de cada placa para um pré-refrigerada 2 ml tubo rotulado. Recolha todas as células em 2 ml tubos. Nota: Use um policial de borracha nova para cada placa para raspar as células de cada placa. Para cada placa, precisaria de quatro tubos de 2 ml, um tubo de 1,5 mL e num frasco de cintilação. </li><li> Rotação a 15000 xg durante 1 min a 4 ° C. </li><li> Retire PBS com uma pipeta, dar uma breve centrifugação e remover o PBS residual. Ressuspender as células em 100 ul de 1x PBS. Vortex para voltar a suspender as células e manter em gelo. </li><li> Pegue 10 &amp;# 956; l a partir do passo 5 e transferir para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e armazenar em gelo para medir a concentração de proteína. Nota: tampão de lise celular deve ser adicionado às células e mantidas em gelo para medir a concentração de proteína mais tarde. </li><li> Girar os restantes 90 mL do passo 5 a 5000 xg durante 30 seg a 4 ° C; remover completamente PBS com uma pipeta de ponta de 200 mL. </li><li> Adicionar 300 ul de tampão de extracção de heme (ver Lista de Materiais) para cada tubo. Então vortex durante 15 segundos para misturar e colocar em gelo durante 1 min, repetir 3 vezes. <ol><li> Adicionar tampão de extracção do heme (Hb) e o tubo rapidamente vortex para ressuspender o sedimento, fazer apenas um ou dois tubos de cada vez, pois o sedimento deverá ser ressuspenso rapidamente sem serem deixados na HEB por muito tempo. Uma vez HEB é adicionado a todos os tubos e sedimento é ressuspenso em seguida, a seguir vórtice e 15 seg 1 min em gelo ciclo como no passo 8. Note que pelete pode não entrar completamente em HEB se o sedimento é deixado no buffer HEB para uma maistempo e não ressuspensas rapidamente. </li></ol></li><li> Adicionar 1,2 ml de éter dietílico e a cada tubo de vórtice durante 30 seg. Rotação a 15000 xg durante 5 min a 4 ° C. Nota: O éter etílico é executado fora de pontas de pipeta rapidamente. Para controlar isso, pipeta éter etílico cima e para baixo uma ou duas vezes, fazer isso ajuda a manter o éter etílico na pipeta. Repita esta cada vez que uma nova ponta de pipeta é usado. </li><li> Transferir fase superior (éter) com 1 ml de pipeta num novo tubo de microcentrifugação. Adicionar 0,5 mL de HCl 2 N, vortex para misturar e centrifugação como no passo 9. Nota: É difícil ver a separação entre as fases de éter e HCl. Por isso, adicionar pequenas quantidades de azul de Tripano em solução de HCl 2 N para ser utilizado durante a experiência, o suficiente para dar uma cor azul pálido. Isso vai ajudar a distinguir as duas fases. A fase mais baixa será azul e a fase de éter superior será incolor. Transferir a fase etérea incolor superior para um novo tubo e descartar a fase HCl (azul) inferior. </li><li> Repita o passo 10 doismais vezes para lavar a fase etérea com 2 N de HCl. Transferir apenas a fase superior com éter para um novo tubo durante cada repetição e eliminar a fase inferior de HCl. </li><li> Após a terceira lavagem com HCl, transferir a fase superior com 1 ml de pipeta para um frasco de cintilação. Secam-se as amostras por evaporação do éter dietílico, mantendo as amostras no capuz química O / N. </li></ol> 3. Medição da radioactividade <ol><li> No dia seguinte, adicionam-se 5 ml de fluido de cintilação para as amostras secas a partir do passo 2.12. </li><li> Agite bem para misturar. Medir a radioactividade utilizando um contador de cintilação. </li></ol> 4. Cálculos <ol><li> Lisar as células do passo 2.6, utilizando quantidades iguais de tampão CelLytic M (ver Materiais List) e centrifugação a 14.000 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Tomar uma aliquota do sobrenadante e medir a concentração de proteína utilizando o kit de ensaio de proteína BCA. A quantidade total de proteína em mg (TP) = (90 ul * conc. De proteína em81; g / mL) / 1000 Nível de síntese do heme (radioatividade / TP) = pmol / mg de proteína. </li></ol>

Não temos nada a divulgar.

O heme desempenha um papel fundamental na geração de energia celular através da respiração 26. Metabolismo do heme Altered é conhecida por estar associada com várias doenças, incluindo cancro 28,41. A inibição da síntese do heme é conhecido por causar a paragem do ciclo celular e apoptose em células Hela 26,41. Demonstrou-se que o nível de síntese de heme está associada com a progressão de células de cancro de pulmão 28. Portanto, seria de grande importânci...

O heme, um complexo de ferro ferroso e protoporfirina IX é uma molécula central para o transporte e a utilização de oxigénio em organismos vivos praticamente todos 1-3. A estrutura única do heme lhe permite funcionar como um transportador de gases diatómicos e electrões, assim como para executar diversas outras funções 1-5. Por exemplo, liga-se ao heme oxigénio na hemoglobina e mioglobina de transferência e armazenagem de 6,7 oxigénio. Ele também funciona como um transportador de electrões nos citocromos durante a respiração e atua como um doador de elétrons para reações redox catalisada por enzimas do citocromo P450 8,9. Uma das características mais significativas do heme é que, pode desempenhar papéis regulatórios em processos celulares e moleculares, como a transcrição de genes, síntese de proteínas e micro-RNA biogênese 4. Por exemplo, afecta a transcrição de muitos genes, controlando a actividade do repressor de transcrição de mamífero Bach1 e o rec nucleares de mamíferoseptor Rev-erbα 10-15. Heme regula a activação do activador de proteína heme (Hap) 1, o qual desempenha um papel importante na activação de genes envolvidos na respiração e controlar os danos oxidativos, em resposta a heme ou oxigénio 16. Heme também regula a transcrição de genes em células neuronais através do factor de crescimento do nervo (NGF) de sinalização 3,17-20. É também regula a síntese de proteínas em células eritróides de mamíferos através da modulação da actividade da heme-reguladas eIF2α quinase (HRI) 21-24. Além disso, o heme afecta a actividade das proteínas principais de sinalização, tais como tirosina-quinase Src e Jak2, que são essenciais para o funcionamento adequado das células e o crescimento de células 4,20,25. Verificou-se que, em células HeLa inibição heme provoca paragem do ciclo celular e a activação de marcadores associados à senescência e a apoptose 26. Tanto a deficiência heme ou aumento dos níveis de heme estão associados com efeitos graves para a saúde em seres humanos 27. Um molecular recentend estudos epidemiológicos têm mostrado uma associação positiva do consumo elevado de heme e aumento do risco de doenças, tais como diabetes tipo 2, doenças coronárias e vários tipos de câncer, incluindo câncer de pulmão, cancro colo-rectal e cancro do pâncreas 27,28. Usando um par combinado de laboratório células pulmonares normais e cancerosas autores descobriram que as células cancerosas se aumentaram os níveis de consumo de oxigênio, a síntese do heme e proteínas envolvidas na absorção de oxigênio heme e utilização 28. Curiosamente, a inibição da síntese do heme diminuição do consumo de oxigénio, proliferação, migração e formação de colónias de células de cancro 28. Deste modo, a flutuação nos níveis de heme endógena desempenha um papel importante na regulação de processos celulares e moleculares 3,4,28,29. Nos mamíferos, a biossíntese do heme ocorre em oito passos, envolvendo enzimas localizadas nas mitocôndrias e o citosol 4 (Figura 1). Heme biostese começa na matriz de mitocôndria com a condensação de glicina e succinil-CoA para formar ácido 5-aminolevulínico (5-ALA), catalisada por sintase de ALA (Alas) 4,31. Este é o passo limitante da velocidade na biossíntese do heme em células nonerythroid. 5-ALA é então exportado para o citosol onde as quatro etapas seguintes ocorrem para formar coproporfirinogênio III (CPgenIII), o qual é então novamente importados para as mitocôndrias, onde é convertido em protoporfirina IX (PPIX). Finalmente, uma molécula de ferro é incorporado à protoporfirina IX (PPIX) para produzir o heme, numa reacção catalisada por ferroquelatase (FEQ) 2,4. O nível da biossíntese do heme depende principalmente do nível de enzima ALA que é rigorosamente controlada por ferro intracelular e heme 4. A biossíntese do heme podem ser afectadas por defeitos genéticos, disponibilidade de certos minerais e vitaminas (por exemplo, riboflavina, zinco), exposição a toxinas (por exemplo, alumínio, chumbo), Anoxia, febre, e os níveis de certos esteróides (por exemplo, estrogénio) 32-35. O nível de síntese do heme é alterada em várias condições de doença. Diminuição da biossíntese do heme pode causar anemia, bem como doenças neurológicas 3,36. Alternativamente, o aumento da biossíntese do heme desempenha um papel importante na progressão de certos cancros 28,37. O heme tem sido demonstrado que é crítica para o crescimento, diferenciação e sobrevivência de tecido adiposo de mamífero, eritróide e de células neuronais 4,38-41. Por exemplo, a deficiência de heme leva a danos de neurites em neurónios corticais de rato primária através da inibição de glutamato de NMDA (N-metil-D-aspartato) do receptor 17. Além disso, a inibição da síntese do heme provoca a morte celular programada no humano Carcinoma epitelial do colo células HeLa 26,41. Portanto, a medição dos níveis de biossíntese do heme em várias células sob diferentes condições é importante para o estudo de etiologia e progressino de muitas doenças. Aqui, descrevemos um método rápido e sensível para medir o nível de síntese do heme intracelular utilizando [4- 14 C] ácido 5-aminolevulic. Este é um método alternativo para os métodos que utilizam outros 55 Fe ou 59Fe. Nós preferimos usar 14 C, porque a sua radiação é muito fraco. Em contraste, a protecção forte é necessário para trabalhar com isótopos Fe. Além disso, este método se destina a medir e comparar a síntese do heme em células diferentes em paralelo de uma maneira rápida. A fim de medir os níveis absolutos de heme, pode-se utilizar o método previamente estabelecido, envolvendo o uso de HPLC de 42,43.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>650501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethy ether</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>296082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (Hydrochloric acid)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A481-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Scintillation cocktail&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>882470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid</td>
			<td>Perkin-Elmer life sciences</td>
			<td></td>
			<td>Store @&#160; -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CelLytic M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2978</td>
			<td>Mammalian cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Specific reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Component</td>
			<td>Dispense</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Heme extraction buffer- Acetone: HCl:Water (25:1.3:5)</td>
			<td>Acetone</td>
			<td>25ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated HCl</td>
			<td>1.3ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>5ml</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of heme synthesis levels in mammalian cells

Heme serve como o grupo prostético de uma grande variedade de proteínas conhecidas como hemoproteinas, tais como a hemoglobina, mioglobina e citocromos. Ele está envolvido em vários processos moleculares e celulares, tais como a transcrição do gene, tradução, diferenciação celular e a proliferação celular. Os níveis de biossíntese do heme variar entre diferentes tecidos e tipos de células e é alterada em condições de doença, tais como a anemia, neuropatia e cancro. Esta técnica utiliza [4- 14 C] ácido 5-aminolevulínico ([14 C] 5-ALA), um dos primeiros precursores na via de biossíntese do heme para medir os níveis de síntese do heme em células de mamíferos. Este ensaio envolve a incubação de células com [14 C] 5-ALA, seguido por extracção do heme e medição da radioactividade incorporada no heme. Este procedimento é preciso e rápido. Este método mede os níveis relativos de heme, em vez de o teor total do heme. Para demonstrar o uso da presente technique os níveis de biossíntese do heme foram medidos em várias linhas de células de mamíferos.

Este método foi utilizado para comparar os níveis de síntese do heme em condições normais (HBEC30KT) vs cancerosas (células de pulmão HCC4017). A Figura 2 mostra um nível mais elevado da síntese de heme em células de cancro (HCC4017) do que as células normais de pulmão (HBEC30KT). O nível de síntese do heme foi medido também em células normais e cancerosas, na presença de cianeto de carbonilo mitocondrial desacoplador 3-clorofenilhidrazona (CCCP). As células foram tratadas com 10 mM de...

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Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Medição dos Níveis de heme em células de mamíferos Síntese

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.0K visualizações.  University of Texas at Dallas. Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Vídeo: Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Trypsinizing e Subcultura células de mamíferos

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Biologia

Bioluminescence Imaging of Heme Oxygenase-1 Upregulation in the Gua Sha Procedure

Gua Sha is a traditional Chinese folk therapy that employs skin scraping to cause subcutaneous microvascular blood extravasation and bruises. The protocol for bioluminescent optical imaging of HO-1-luciferase transgenic mice reported in this manuscript provides a rapid in vivo assay of the upregulation of the heme oxygenase-1 (HO-1) gene expression in response to the Gua Sha procedure. HO-1 has long been known to provide cytoprotection against oxidative stress. The upregulation of HO-1, assessed by the bioluminescence output, is thought to represent an antioxidative response to circulating hemoglobin products released by Gua Sha. Gua Sha was administered by repeated strokes of a smooth spoon edge over lubricated skin on the back or other targeted body part of the transgenic mouse until petechiae (splinter hemorrhages) or ecchymosis (bruises) indicative of extravasation of blood from subcutaneous capillaries was observed. After Gua Sha, bioluminescence imaging sessions were carried out daily for several days to follow the dynamics of HO-1 expression in multiple internal organs.

Gua Sha, traditional Chinese therapeutic skin scraping, causes subcutaneous microvascular blood extravasation. We report a protocol of bioluminescence imaging of HO-1-luciferase transgenic mice to demonstrate that Gua Sha upregulates heme oxygenase-1 (HO-1) in multiple organs.

Imagem de bioluminescência de heme oxigenase-1 Upregulation no Procedimento de Gua Sha

Gua Sha is a traditional Chinese folk therapy that employs skin scraping to cause subcutaneous microvascular blood extravasation and bruises. The protocol ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

Fracionamento em Subcelulares situ de aderentes e não aderentes células de mamíferos

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

Análise de DNA dupla fita-Break Repair (DSB) em células de mamíferos

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

EsiRNA MISSÃO para a seleção RNAi em células de mamíferos

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Análise de Cinética mRNA Nuclear Exportação em células de mamíferos por microinjeção

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to knockdown gene expression levels in loss of gene function studies.
There are two main methods for performing RNAi. The first is the use of small interfering RNAs (siRNAs) that are chemically synthesized, and the second utilizes short-hairpin RNAs (shRNAs) encoded within plasmids 1. The latter can be transfected into cells directly or packaged into replication incompetent lentiviral particles. The main advantages of using lentiviral shRNAs is the ease of introduction into a wide variety of cell types, their ability to stably integrate into the genome for long term gene knockdown and selection, and their efficacy in conducting high-throughput loss of function screens. To facilitate this we have created the LentiPlex pooled shRNA library.
The MISSION LentiPlex Human shRNA Pooled Library is a genome-wide lentiviral pool produced using a proprietary process. The library consists of over 75,000 shRNA constructs from the TRC collection targeting 15,000+ human genes 2. Each library is tested for shRNA representation before product release to ensure robust library coverage. The library is provided in a ready-to-use lentiviral format at titers of at least 5 x 108 TU/ml via p24 assay and is pre-divided into ten subpools of approximately 8,000 shRNA constructs each. Amplification and sequencing primers are also provided for downstream target identification.
Previous studies established a synergistic antitumor activity of TRAIL when combined with Paclitaxel in A549 cells, a human lung carcinoma cell line 3, 4. In this study we demonstrate the application of a pooled LentiPlex shRNA library to rapidly conduct a positive selection screen for genes involved in the cytotoxicity of A549 cells when exposed to TRAIL and Paclitaxel. One barrier often encountered with high-throughput screens is the cost and difficulty in deconvolution; we also detail a cost-effective polyclonal approach utilizing traditional sequencing.

Here we use a human LentiPlex pooled library and traditional sequencing methods to identify gene targets promoting cell survival. We demonstrate how to set up and deconvolute a LentiPlex screen and validate the results.

LentiPlex MISSÃO Pooled shRNA Screening Biblioteca em células de mamíferos

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Análise da posição do ciclo celular em células de mamíferos

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

Visualização de mRNAs retículo endoplasmático localizados em células de mamíferos

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

Methods Article

Medição dos Níveis de heme em células de mamíferos Síntese